Identifikasjon av koding og ikke-koding RNA klasser uttrykt i svin fullblod
Summary
Her presenterer vi en protokollen optimert for behandling av koding (mRNA) og ikke-koding (ncRNA) globin redusert RNA-seq biblioteker fra en enkelt hele blodprøve.
Abstract
Advent innovativ og stadig kraftigere neste generasjons sekvensering teknikker har åpnet nye muligheter i muligheten til å undersøke det underliggende genuttrykk knyttet til biologiske prosesser rundt. Disse nyvinningene gjør ikke forskere å observere uttrykk fra mRNA sekvensene som kode for gener som effekten cellulære funksjoner, men også ikke-koding RNA (ncRNA) molekyler som forbli uoversatt, men likevel har regulatoriske funksjoner. Selv om forskere har muligheten til å observere både mRNA og ncRNA, har det vært vanlig for en studie for å fokusere på ett eller annet. Men når studier er interessert i både mRNA og ncRNA uttrykk, bruker mange ganger de separate prøver for å undersøke koding eller ikke-koding RNAs på grunn av forskjellen i biblioteket forberedelser. Dette kan føre til behovet for flere prøver som kan øke tid, forbruksvarer og dyr stress. I tillegg kan det føre forskerne å avgjøre å forberede prøver eneste analyse, vanligvis mRNA, begrense antall biologiske spørsmål som kan bli undersøkt. Men ncRNAs spenner over flere klasser med regulatoriske roller effekt mRNA uttrykket. Fordi ncRNA er viktig grunnleggende biologiske prosesser og forstyrrelse av disse prosessene i under infeksjon, kan de derfor gjøre attraktiv mål for therapeutics. Dette manuskriptet viser en endret protokoll for generasjon mRNA og ikke-koding RNA uttrykk biblioteker, inkludert viral RNA, fra et enkelt utvalg av fullblod. Optimalisering av denne protokollen, forbedret RNA renhet, økt ligation for utvinning av denaturert RNAs og utelatt størrelse utvalg, for å tillate fangst av flere RNA arter.
Introduction
Neste generasjons sekvensering (NGS) har dukket opp som et kraftig verktøy for etterforskningen av endringene som oppstår på genomisk nivå biologiske organismer. Eksempel forberedelse til NGS metoder kan endres avhengig av organismen, vev type, og enda viktigere spørsmålene forskerne er opptatt av å adresse. Mange studier har slått til NGS som studerer forskjellene i genekspresjon mellom stater som sunn og syke individer1,2,3,4. Sekvensering ta plass på hele genomet basis og lar forsker å fange mest, om ikke alle, genomisk informasjon for en bestemt genetisk markør gangen pek.
Den vanligste markører uttrykksformer observert er messenger RNAs (mRNAs). Mest brukte prosedyrene for fikse biblioteker for RNA-seq er optimalisert for utvinning av mRNA molekyler ved hjelp av en rekke renselser, fragmentations og ligations5,6. Men avhenger beslutningen om hvordan en protokoll er utført svært mye på prøvetype og spørsmålene som stilles om sa prøven. I de fleste tilfeller trekkes totale RNA; Likevel, ikke alle RNA molekyler er av interesse og i slike tilfeller mRNA uttrykk studier altfor rikelig RNA arter, som ribosomal RNAs (rRNA) må fjernes for å øke antall synlig transkripsjoner knyttet til mRNAs. Den mest populære og brukte metoden for å fjerne rikelig rRNA molekylene er reduksjonen av polyadenylated RNA transkripsjoner kalles polyA uttømming7. Denne tilnærmingen fungerer godt for analyse av mRNA uttrykk som påvirker mRNA transkripsjoner. Men i studier som er interessert i ikke-koding eller viral RNAs, fjerner polyA uttømming også disse molekyler.
Mange studier vil fokusere på RNA sekvens biblioteket utarbeidelse undersøke enten mRNA uttrykk (koding) eller en bestemt klasse av små eller store ikke-koding. Selv om det er andre prosedyrer8 som vår at to utvalg forberedelse, forberede mange studier biblioteker fra separate prøver separate studier når tilgjengelig. For en studie som vår krever dette vanligvis flere blodprøver øke tid, forbruksvarer og dyr stress. Målet med vår studie var å kunne bruke hele blod fra dyr til å identifisere og telle de forskjellige klassene av både mRNA og ikke-koding RNA uttrykt mellom sunn og svært patogene svin reproduksjons- og åndedretts syndrome virus (HP-PRRSV) utfordret griser9,10 til tross for at bare en enkelt hele blodprøve (2.5 mL) fra hver gris. For dette, måtte vi optimalisere typisk utvinning og biblioteket etablering protokoller generere riktige data å tillate analyse av både mRNA og ikke-koding RNA (ncRNA) uttrykk11 fra et enkelt utvalg.
Dette bedt om et behov for en protokoll som er tillatt for mRNA og ikke-koding RNA analyse fordi tilgjengelig standard kits og metoder for oppretting av RNA-utvinning og biblioteket var ment hovedsakelig for mRNA og bruke en poly-A uttømming trinn12. Denne steg ville ha gjort det umulig å gjenopprette ikke-koding RNA eller viral transkripsjoner fra utvalget. Derfor en optimalisert metode var nødvendig som tillatt for totale RNA utvinning uten prøve polyA uttømming. Metoden presentert i dette manuskriptet er blitt optimert å tillate bruk av fullblod som en prøve og bygge sekvensering biblioteker for både mRNA og ncRNAs av små og store størrelser. Metoden har blitt optimalisert for å tillate for analyse av alle oppdages ikke-koding RNAs samt beholde viral RNAs for senere undersøkelser13. I alle tillater våre optimalisert biblioteket forberedelse protokollen for etterforskningen av flere RNA molekyler fra en enkelt hele blodprøve.
Det overordnede målet bak bruken av denne metoden var å utvikle en prosess som er tillatt for innsamling av både ikke-koding RNA og mRNA fra et utvalg av hele blod. Dette tillater oss å ha mRNA, ncRNA og viral RNA for hvert dyr i vår studie fra en enkelt prøve9. Dette til slutt gir mer vitenskapelige funn uten tilleggskostnader dyr og gir et mer komplett bilde av uttrykk for hver enkelte eksempel. Metoden beskrevet tillater undersøkelse av regulatorer av genuttrykk samt tillater gradering av correlative sammenligne begge mRNA og ikke-koding RNA uttrykk ved hjelp av en enkelt hele blodprøve. Vår studie brukt denne protokollen til å undersøke endringer i genuttrykk og mulig epigenetic regulatorer i virally infiserte 9 – uke gamle mannlige kommersielle griser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det første kritiske trinnet i protokollen som gjorde det optimalisert inkludert lagt globin uttømming trinnene, som gjorde det mulig å få kvalitet leser fra hele blodprøver. En av de største begrensningene på bruk fullblod i sekvensering studier er det høye antallet leser i utvalget som tilordnes globin molekyler og redusere lest som kan tilordnes til andre molekyler rundt18. Derfor optimalisere protokollen for vår eksempel type, trengte vi å innlemme en globin uttømming trinn for å si…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet var hovedsakelig støttes av den av USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, og delvis av USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Denne studien ble støttet delvis av utnevnelsen Agricultural Research Service deltakelse forskningsprogrammet administrert av Oak Ridge Institutt for vitenskap og utdanning (ORISE) gjennom en interagency avtale mellom US Department of Energy ( DOE) og det amerikanske Landbruksdepartementet. ORISE administreres av Oak Ridge tilknyttet universiteter DOE kontrakt ikke. DE-AC05-06OR2310.
Vi vil gjerne takke Dr. Kay Faaberg for HP-PRRSV smittsomme kloner, Dr. Susan Brockmeier hennes hjelp med dyr involvert i forsøket, og Sue Ohlendorf sekretær hjelp med utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Referencias
- Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
- Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
- Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
- Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).
- Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
- Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
- Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
- Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
- . TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
- . New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018)
- Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).
