Identificatie van de codering en niet-coderende RNA klassen uitgedrukt in varkens volbloed

Volgende generatie sequencing (NGS) heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van de veranderingen die zich op het genomisch niveau van biologische organismen voordoen. Bereiding van de monsters voor NGS methoden kan gevarieerd worden afhankelijk van het organisme, weefseltype, en wat nog belangrijker is het vragen de onderzoekers graag adres. Vele studies hebben aan NGS gedraaid als een middel van het bestuderen van de verschillen in genuitdrukking tussen staten zoals gezonde en zieke personen^1,,^2,,^3,4. De sequencing nemen plaats op basis van de hele genoom en laat een onderzoeker te vangen de meeste, zoniet alle, genomische informatie voor een bepaalde genetische marker tegelijkertijd wijs.

De meest voorkomende markeringen van meningsuiting waargenomen zijn de messenger RNAs (mRNAs). De meest gebruikte procedures voor prepping bibliotheken voor RNA-seq zijn geoptimaliseerd voor het herstel van mRNA moleculen door middel van een reeks van zuivering, breukpatroon en ligations^5,6. Echter afhankelijk het besluit over de wijze waarop een protocol worden uitgevoerd sterk van het type van de steekproef en de vragen over het genoemde monster. In de meeste gevallen wordt de totale RNA geëxtraheerd; echter niet alle RNA-moleculen zijn van belang en in gevallen zoals mRNA expressie studies al te overvloedige RNA-soorten, zoals ribosomaal RNAs (rRNA) moet worden verwijderd om het aantal detecteerbare afschriften die is gekoppeld aan de mRNAs verhogen. De meest populaire en meest gebruikte methode voor het verwijderen van de overvloedige rRNA moleculen is de vermindering van de polyadenylated RNA afschriften polyA uitputting⁷hierna. Deze aanpak werkt goed voor de analyse van mRNA uitdrukking zoals doet geen afbreuk aan de transcripten van mRNA. Echter in studies die geïnteresseerd zijn in niet-coderende of virale RNAs polyA uitputting verwijdert u ook deze moleculen.

Veel studies verkiezen te concentreren op de RNA reeks bibliotheek voorbereiding om te onderzoeken of mRNA uitdrukking (coderen) of een bepaalde categorie van kleine of grote niet-coderende RNA. Hoewel er andere procedures⁸ als de onze die het mogelijk voor de bereiding van de monsters van de dual maken, bereiden veel studies bibliotheken van afzonderlijke monsters voor afzonderlijke studies beschikbaar. Voor een studie als de onze, zou dit normaal gesproken meerdere bloedmonsters stijgende tijd, verbruiksartikelen, en dieren stress vereisen. Het doel van deze studie was om het gebruik van bloed van dieren te identificeren en kwantificeren van de verschillende klassen van beide mRNA te kunnen en niet-coderende RNA uitgesproken tussen gezonde en hoogpathogene varkens reproductieve en respiratoir syndroom virus (HP-PRRSV) uitgedaagd varkens^9,10 ondanks het feit dat slechts een enkele volbloed steekproef (2,5 mL) van elk varken. Om dit te doen, die we nodig hadden om de typische extractie en bibliotheek creatie protocollen voor het genereren van de juiste gegevens te voorzien van analyse van mRNA zowel niet-coderende RNA (ncRNA) expressie¹¹ van één sample te optimaliseren.

Dit leidde tot een behoefte aan een protocol dat is toegestaan voor mRNA en analyse van niet-coderende RNA omdat de beschikbare standaard kits en de methoden voor RNA-extractie en bibliotheek creëren bestemd waren voornamelijk voor mRNA en gebruik een poly-A uitputting stap¹². Deze stap zou hebben gemaakt het onmogelijk om te herstellen van niet-coderende RNA of virale afschriften uit het monster. Dus, een geoptimaliseerde methode nodig was dat toegestaan voor totale RNA extractie zonder monster polyA uitputting. De methode voorgesteld in dit manuscript is geoptimaliseerd voor het gebruik van volbloed als een monster type toestaan en sequencing bibliotheken te bouwen voor zowel mRNA en ncRNAs voor kleine en grote maten. De methode is geoptimaliseerd om te voorzien in de analyse van alle aantoonbaar niet-coderende RNAs evenals virale RNAs voor later onderzoek¹³behouden. In alle zorgt ons geoptimaliseerde bibliotheek voorbereiding protocol voor het onderzoek van meerdere RNA-moleculen uit een monster van één volbloed.

Het algehele doel achter het gebruik van deze methode was een proces dat is toegestaan voor de collectie van zowel niet-coderende RNA en mRNA uit één monster van volbloed te ontwikkelen. Daardoor kunnen we in onze studie afkomstig uit een monster⁹mRNA, ncRNA, en virale RNA voor elk dier hebben. Dit, uiteindelijk zorgt voor meer wetenschappelijke ontdekking zonder dierlijke meerkosten en geeft een completer beeld van de expressie van elk individuele monster. De beschreven methode geschikt is voor het onderzoek van de regelgevers van genexpressie, alsook het zodat voor voltooiing van oereenstemming studies vergelijken beide mRNA en niet-coderende RNA expressie met behulp van een enkel geheel bloedmonster. Onze studie gebruikt dit protocol te onderzoeken van de wijzigingen in genexpressie en mogelijk epigenetische regelgevers in viraal geïnfecteerde 9 – weken oude mannelijke commerciële varkens.