猪全血表达编码和非编码 rna 类的鉴定
Summary
在这里, 我们提出了一个协议优化的处理编码 (mrna) 和非编码 (ncrna) 全球减少 rna-seq 库从一个单一的全血样本。
Abstract
创新且日益强大的下一代测序技术的出现为研究与所感兴趣的生物过程相关的潜在基因表达的能力开辟了新的途径。这些创新不仅使研究人员能够从编码影响细胞功能的基因的 mrna 序列中观察表达, 而且还可以观察到仍未翻译但仍具有调控功能的非编码 rna (ncRNA) 分子。尽管研究人员有能力观察 mrna 和 ncrna 的表达, 但研究的习惯是关注其中的一种。然而, 当研究对 mrna 和 ncrna 表达感兴趣时, 由于图书馆准备工作的差异, 很多时候它们使用单独的样本来检查编码或非编码 rna。这可能会导致需要更多的样品, 这可能会增加时间、消耗品和动物压力。此外, 它可能会导致研究人员决定只为一种分析准备样本, 通常是 mrna, 从而限制可以调查的生物问题的数量。然而, ncrna 跨越多个类, 具有影响 mrna 表达的调节作用。由于 ncrna 对基本的生物过程和感染过程中的紊乱很重要, 因此, 它们可能会成为有吸引力的治疗目标。这份手稿演示了一个改进的协议, 用于从一个完整的血液样本生成 mrna 和非编码 rna 表达库, 包括病毒 rna。优化该协议, 提高 rna 纯度, 增加结扎恢复甲基化 rna, 并省略大小选择, 以允许捕获更多的 rna 物种。
Introduction
下一代测序 (ngs) 已成为研究生物有机体基因组水平变化的有力工具。ngs 方法的样品制备可以根据生物体、组织类型以及更重要的是研究人员渴望解决的问题而有所不同。许多研究转向 ngs 作为研究健康和患病个体 1、2、3、4等国家之间基因表达差异的一种手段。测序是在整个基因组的基础上进行的, 研究人员可以在某个时间点捕获特定遗传标记的大部分 (如果不是全部的话) 基因组信息。
观察到的最常见的表达标记是信使 rna (mrna)。rna-seq 准备库的最常用的过程是通过使用一系列纯化、碎裂和结扎5、6 来优化 mrna 分子恢复的。但是, 有关如何执行协议的决定在很大程度上取决于样本类型和对所述示例提出的问题。在大多数情况下, 总 rna 被提取;然而, 并不是所有的 rRNA 分子都有兴趣, 在 mrna 表达研究等情况下, 过度丰富的 rRNA 物种, 如核糖体 rRNA (rrna) 需要删除, 以增加可检测的转录与 mrna 相关的数量。去除丰富的 rrna 分子最流行和最广泛使用的方法是减少被称为多 a 消耗7的多腺苷酸 rRNA转录。这种方法很好地用于 mrna 表达的分析, 因为它不影响 mrna 转录。然而, 在对非编码或病毒 rna 感兴趣的研究中, 多 a 消耗也会去除这些分子。
许多研究选择专注于 rna 序列库的准备, 以检查 mrna 表达 (编码) 或特定类别的小或大的非编码 rna。虽然还有其他程序8像我们这样的程序, 允许双重样品制备, 许多研究准备图书馆从单独的样本为单独的研究, 如果可用。对于我们这样的研究, 这通常需要多个血液样本来增加时间、消耗品和动物压力。我们的研究目标是能够使用动物的全血来识别和量化健康和高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒 (hp-prrsv) 之间表达的不同类别的 mrna 和非编码 rna挑战猪9,10 尽管只有一个全血样本 (2.5 毫升) 从每头猪。为了做到这一点, 我们需要优化典型的提取和库创建协议, 以生成适当的数据, 以便从单个样本中分析 mrna 和非编码 rna (ncrna) 表达 11.
这就需要制定一项协议, 允许 mrna 和非编码 rna 分析, 因为用于 rna 提取和库创建的现有标准试剂盒和方法主要用于 mrna, 并使用多 a 消耗步骤12。这一步将使其无法从样本中恢复非编码 rna 或病毒转录。因此, 需要一种优化的方法, 允许在不消耗样品多 a 消耗的情况下提取总 rna。本手稿中介绍的方法经过了优化, 允许将全血作为样本类型使用, 并为大小的 mrna 和 ncrna 建立测序库。该方法经过优化, 可以分析所有可检测到的非编码 rna, 并保留病毒 rna 供以后调查13。总之, 我们优化的库制备协议允许从一个完整的血液样本中调查多个 rna 分子。
使用这种方法的总体目标是开发一个过程, 允许从一个全血样本中收集非编码 rna 和 mrna。这使我们能够对我们研究中的每一种动物拥有来自单个样本9的 mrna、ncrna 和病毒 rna。这最终可以在不增加动物成本的情况下进行更多的科学发现, 并更完整地反映每个样本的表达。所述方法允许检查基因表达的调节剂, 并允许完成使用单个全血样本比较 mrna 和非编码 rna 表达的相关研究。我们的研究使用这个协议来研究基因表达的变化和可能的表观遗传调节剂在病毒感染的9周大的雄性商业猪。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议中优化的第一个关键步骤包括增加的球蛋白耗尽步骤, 这使得从全血样本中获得高质量的读数成为可能。在测序研究中使用全血的最大限制之一是样本中的大量读数, 这些读数将映射到全球分子, 并减少可映射到其他感兴趣的分子的读数.因此, 在优化样本类型的协议时, 我们需要加入一个全局损耗步骤, 以确保通过测序实现尽可能高的 mrna 和非编码 rna 捕获。根据 choi等</em…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作主要得到了美国农业部 nifa afri 2013-67015-21236 的支持, 部分得到了美国农业部 nifa afri 2015-66015-23216 的支持。这项研究得到了美国能源部 (美国能源部) 之间机构间协议任命的由橡树岭科学和教育研究所 (orise) 管理的农业研究服务研究参与方案的部分支持。美国能源部) 和美国农业部。orise 由橡树 ridge 相关大学根据指定经营实体合同号管理。de-ac05-6or2310。
我们要感谢 kay faaberg 博士的 hp-prrs 感染克隆, susan Brockmeier 博士为参与实验的动物提供了帮助, sue ohlendorf 博士为编写手稿提供了秘书协助。
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Referencias
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