一种研究受体配体相互作用的 bw 报告系统

1. 表达奇美体结构的质粒的产生 注: 目的是产生一个质粒, 表达兴趣受体的细胞外域融合到小鼠 cd3 卵链的跨膜和细胞内域 (图 2a)。 检索包括信号肽在内的感兴趣受体的细胞外域序列。获取有望表达此受体的 dna 材料 (例如, cdna 或质粒)。 获取表达小鼠 cd3 链 (如cdna 或质粒) 的跨膜和细胞内域的 dna 材料。 根据图 2a所示的一般结构设计融合蛋白的序列。确保整个序列在同一个密码子读取框架内。此序列用于设计适当的引物并验证最终产品。 设计两个 pcr 反应, 分别扩增融合蛋白的每个片段 (图 2b, 2c)10。注: pcr 反应的具体条件 (例如, 伸长时间和退火温度) 取决于引物的性质, 引物是为特定受体设计的。 放大受体的细胞外段。 设计一个 5 ‘ 的引物, 包括受体的部分信号肽、一个 kozak 共识序列和一个适当的限制位点 (图 2b)。 设计一个 3 ‘ 底漆, 侧翼融合蛋白的两个部分 (图 2b)。例如, 对于初始设计, 此 3 ‘ 引物可以包括受体的细胞外段的最后20个碱基对和 cd3 段的前9个碱基对。注: 没有必要在 3 ‘ 底漆中添加限制站点, 因为此引物将用于生成融合序列, 而不用于结扎。 放大 cd3 段。 设计一个 5 ‘ 底漆, 侧翼融合蛋白的两个部分 (图 2c)。例如, 对于初始设计, 5 ‘ 引物可以包括受体细胞外段的最后9个碱基对和 cd3 段的前20个碱基对。注: 没有必要在 5 ‘ 底漆中添加限制站点, 因为此引物将用于生成融合序列, 而不用于结扎。 设计一个 3 ‘ 的引物, 其中包括 cd3 序列的末端以及一个适当的限制站点 (图 2c)。 更正这两种反应中每一种反应中的引物序列, 使退火温度在每一对中都是相似的 (请注意, 引物包括融合蛋白的两个部分的序列, 只有在每个反应中的序列的一部分退火)。 执行一个额外的 pcr, 其中使用前两种反应的 pcr 产物的混合物作为 dna 模板, 其中包括细胞外受体段的 5 ‘ 引物 (步骤 1.4.1.1) 和 cd3 段的 3 ‘ (步骤 1.4.2.2) (图 2d)10.这种反应应该会产生最终的融合序列。 像往常一样进行克隆。 将最终 pcr 产物与目标切割载体 (目标载体通常是 pcdna3, 表达 g418 和氨匹西林的耐受性)。 将结扎的载体转化为合格的细菌11。 在冰上解冻50μl 的有能力的细菌。 将结扎载体添加到细菌中, 在冰上孵育20分钟。 在42°c 下孵化45秒。 在没有抗生素的情况下加入200μl 的 lb。 在37°c 下连续晃动, 孵化1小时。 具有适当抗生素的 lb 板上的种子 (例如, 最终浓度为 0.1 mg/ml 的氨匹西林溶液)。 在 lb 的5毫升 (15 毫升管中) 中收集和生长多个细菌菌落。 第二天, 用迷你准备试剂盒提取质粒。 用限制性酶分析基因插入物。 对相关的菌落进行排序, 并验证序列和读取帧是否正确 (如步骤1.3 中所示)。 将已验证的质粒转化为有能力的细菌11。 在冰上解冻20μl 的有能力的细菌。 将1μl 的质粒加入细菌, 在冰上孵育20分钟。 在42°c 下孵化45秒。 在没有抗生素的情况下加入200μl 的 lb。 在37°c 下连续晃动, 孵化1小时。 具有适当抗生素的细菌生长板上的种子 (例如, 最终浓度为 0.1 mg/ml 的氨匹西林溶液)。 第二天, 在一个大的 lb 容器中种植细菌菌落, 容器中含有 0.1 mgml 安培 (~ 250 毫升)。 第二天, 根据套件提供的具体说明进行最大准备。注: 对于电穿孔程序, 需要大量质粒, 详情如下。 2. 表达壳蛋白的质粒转染 bw 细胞 注: 转染也可采用不同的方法 (例如, 通过慢病毒感染)。在电穿孔之前, 执行 dna 的乙醇沉淀, 如下所述。接下来的步骤需要无菌条件。 前天, 准备 bw5147 细胞 (“bw 细胞”) 进行电穿孔。板10板 (10 厘米) 与10毫升的 100, 000 bw5147 cellsl (即总共 10 x10 6 细胞) 与 rpmi 补充10% 胎儿小牛血清 (fcs), 1% 丙酮酸钠, 1% l-谷氨酰胺, 1% 非必要氨基酸和1%青霉素链霉素 (“完整培养基”)。 将表达融合蛋白的 pcdna3 质粒100微克放入 1.5-2ml 管中, 并在 ph 值5.3-5.5 处加入 3 m 醋酸钠。醋酸钠的体积应相当于100微克质粒体积的 0.1 (10%); 通过添加 naoh 或 hcl, 用 ph 计滴定醋酸钠的 ph 值。 如步骤2.2 所述 (质粒和醋酸钠总量的 2.5倍), 在质粒和醋酸钠的混合物中加入2.5 体积的100% 乙醇。在-20°c 下过夜或在70°c 下过夜2小时。 2.4. 在 bw 细胞镀膜24小时后, 将所有 bw 细胞 (~ 100 ml) 收集到 2 50 ml 管中。在 515 x 克离心细胞5分钟, 并丢弃上清液。 在一个50毫升的管中, 将两个管中的颗粒重新悬浮在一个50毫升的管中, 从25毫升的 rpmi 中重新悬浮。例如, 重新悬浮一个管的颗粒与25毫升的 rpmi-, 然后使用这种液体重新悬浮在另一个50毫升管的液体, 使 bw 细胞的总颗粒重新悬浮在25毫升的介质在一个单一的管。注: 介质应不添加, 因为血清可能会干扰电穿孔。 在 515 x克的情况下再次离心细胞5分钟。将颗粒重新悬浮在 rpmi 的1毫升中, 并将其转移到冰上0.4 厘米的立方。 在 16, 000 x g 和4°c 条件下, 将经过乙醇沉淀的质粒 ( 步骤 2.3) 离心30分钟。 用1毫升的70% 乙醇和离心机清洗一次, 在 16, 000 x g和4°c 的温度下再清洗 20分钟 (将盐洗掉)。 取出所有乙醇, 让颗粒稍微干燥 (即, 在组织培养罩中的一个开放的管)。用以前加热到60°c 的100μl 的 rpmi 重新悬浮颗粒。 将重新悬浮的质粒 (步骤 2.8) 加入幼杯中的细胞, 在冰上孵育5分钟。 将电池以 0.23 kv, 250 电容进行电穿孔。这应该需要 ~ 4 毫秒。 将电穿孔细胞转移到50毫升管中, 在 515 x 克处加入50毫升的完整介质和离心机5分钟. 丢弃上清液, 用50毫升的完整培养基重新悬浮细胞。 将电穿孔细胞放入24井培养盘中 (每口1毫升, 共 ~ 50 口井), 在37°c 和 5% co 2 下孵育 48小时. 用抗生素选择转染的细胞。在48小时后添加1毫升的完整介质, 加上 10 mgl g418 对每口井 (在现阶段, 每口井的最终体积为2毫升, 每口井的 g418 的最终浓度为 5 mg/ml)。注: 如果质粒含有不同的抗生素耐药性, 请在此步骤之前确定杀死未转染的 bw 细胞所需的抗生素浓度。 每 48小时, 小心地丢弃每口井的上体积1毫升, 而不搅拌井中的介质 (bw 细胞往往位于井底)。在每口井上加入完整的介质, 加上 5 mg/gl g418, 使每口井的最终体积再增加2毫升。 定期检查所有油井的培养板的细胞生长情况。注: 介质颜色变化为黄色可能有助于识别生长细胞;然而, 在开始的媒介将是黄色的, 因为 g418 本身。识别正井 (有生长细胞的井)。这些井具有 g418 耐药性, 因此有望表达融合蛋白。这个过程通常需要 ~ 3周。 3. 验证转化受体在阳性井细胞中的表达。 用对转染受体的特定抗体染色转染 bw 细胞。 将流式细胞术表达受体与对照细胞 (未转染的 bw 细胞) 的表达进行比较。 在验证了一个或多个井之后, 立即将细胞用于实验目的, 在培养中生长, 或在将来的应用中冻结。 在进行新实验之前, 验证转染受体的表达。经过几个星期的生长, 具有稳定受体表达的 g418 细胞 g418 可以从培养基中省略。 4. 带目标的转染 bw 细胞的孵化 注: 首次使用转染的 bw 细胞时, 最好在表达感兴趣受体的已知配体的目标上或专门针对感兴趣的受体的板状抗体上进行测试 (交联)实验;见下文4.2.1.3 节)。 优选地在实验前24小时分裂 bw 细胞 (例如, 在新的10厘米培养基中添加10毫升的完整培养基至2毫升细胞)。 用转染的 bw 细胞的目标进行培养。在表示空向量 (或亲本 bw 单元) 的控制 bw 单元上同时执行实验。96f 板更可取 (但也可以使用96F 板)。把实验做一式三份。挂起完整介质中的所有单元格。 准备好目标目标的类型随目标的函数而变化, 可以是细胞、用抗体预先培养的细胞, 也可以是单独的抗体。该系统还以细菌为靶点5使用。 如果目标是分裂细胞 (即细胞系), 在检测前将其照射在 6000 rad 处。将 50, 000个靶细胞放入96板的单井中 (体积为 100μl)。 对于表达人 fcγr 的抗体和 bw 细胞的实验, 在96孔板 (例如, 目标细胞50μl 和抗体 50μl; 可以测试不同的抗体剂量) 中的冰上培养目标细胞。 如果单独使用抗体作为靶点 (交联实验), 就应该对其进行平台约束。为此, 首先在37°c 和 5% co 2 的9十二f 板中的一个完整培养基中培养抗体, 时间为 2小时 (在 50μl 条件下, 典型的起始剂量为特定抗体的0.5 微克)。清洗盘子, 去除未绑定的抗体。注: 在这种情况下, 96f 板将使抗体结合到板, 这之后转染的 bw 细胞将导致转染受体的激活。 添加 bw 单元格 (效应单元格)。将 50, 000个 bw 电池放入96板的一口井中 (体积为 100μl)。 如有必要, 将每口井中的体积完成200μl。 在37°c 和 5% co2 下将板材培养 48小时 (这段时间可以校准)。 48小时后, 将板冻结在-20°C, 并在 elisa 之前解冻, 或立即用于 elisa (请参阅后续步骤)。 5. 酶联免疫吸附 用抗小鼠 il-2 抗体 (抗 mil-2) 涂上 elisa 板。将0.05μg 的抗 mil-2 放入50μl 的体积中, 每口 1 x pbs。在4°c 或37°c 时, 用抗 mil-2 抗体将涂层 elisa 板隔夜培养2小时。注: 要在潜伏期后直接进行 elisa, elisa 板应在 bw 细胞潜伏期结束前24小时涂覆。 丢弃 elisa 板中的液体, 加入由 1x pbs 和1% 牛血清白蛋白 (bsa) 组成的阻滞溶液 (每口井 200μl)。在室温下将 elisa 板培养2小时。 用0.05% 的 pbs tween 溶液 (即在1 升1升 pbs 中的 tewen-20 0.5 ml) 清洗 elisa 板三次。 以96片为例, 其中有与目标孵育的 bw 细胞 (4.3)。如果盘子被冷冻, 完全解冻 (例如, 在37°c 下进行短距离孵育)。离心96板 (5分钟, 515 x g), 并小心地将每口井中的100微克上清液转移到预涂布和堵塞的 elisa 板上。注: 上清液应从每口井的两侧收集, 以避免取细胞。 如果需要, 将具有定义浓度的重组 mil-2 添加到涂层 elisa 板的空行中, 以生成 mil-2 的标准曲线。例如, 从 mil-2 浓度 2, 500 pgml 开始, 然后在以后的每口井中减少 50%;不要在最后一口井中添加 mil-2。 在4°c 下隔夜或37°c 时将 elisa 板培养2小时。 用 pbs 补间清洗弹性免疫板四次。 在 elisa 板中加入生物素抗小鼠白细胞介素-2。在1毫升的 1x pbs 中使用1μg 抗体的浓度, bsa 为 1%, 并分为 100μl/口。 在室温下孵化1小时。 用 pbs 补间清洗弹性免疫板六次。 添加 hrp 共轭链霉素。在 1 毫升的 pbsx1 中使用1μl链霉素的浓度和 1% 的 bsa , 并将其分为100μl / 。 在室温下孵化30分钟。 用 pbs 补间清洗弹性免疫板六次。 每井添加100μl 的 tmb 基板溶液。快速完成此阶段, 以最大限度地减少添加 tmb 时由于时滞而导致的油井之间的差异。 阅读 elisa 板与 elisa 板读取器在 650 nm (读取可以重复, 如果信号弱)。