Gleichzeitige Quantifizierung von Anti-Vektor- und Anti-Transgen-spezifische CD8+ T Zellen über MHC Tetramer Färbung nach der Impfung mit viralen Vektoren
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ex Vivo qualitativen Nachweis von Antigen-spezifischen CD8+ T Zellen. Analyse ist möglich mit einzelnen Zellsuspensionen von Organen oder geringe Mengen von Blut. Ein breites Spektrum an Studiengängen erfordert die Analyse der zytotoxischen T-Zell-Antworten (Impfung und Krebs-Immuntherapie-Studien).
Abstract
Nach Virusinfektion, Antigen-spezifische CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTLs) entstehen und tragen zur Beseitigung der infizierten Zellen, die Verbreitung von Krankheitserregern zu verhindern. Daher ist die Häufigkeit der Antigen-spezifischen CTLs bezeichnend für die Stärke der T-Zell-Reaktion gegen ein spezifisches Antigen. Eine solche Analyse ist wichtig in grundlegenden Immunologie, Entwicklung von Impfstoffen, Krebs Immunbiologie und adaptive Immunologie. Im Feld Impfstoff bestimmt die CTL-Antwort gegen Komponenten des viralen Vektoren wie effektiv ist die Generation der Antigen-spezifische Zellen gegen das Antigen des Interesses (z.B., Transgen). Antigen-spezifischen CTLs können entweder durch Stimulation mit bestimmten Peptiden, gefolgt von intrazellulären Zytokin Färbung oder durch die direkte Färbung des Antigen-spezifische T-Zell-Rezeptoren (TCR) und Analyse von Durchflusszytometrie erkannt werden. Die erste Methode ist sehr zeitaufwendig, da es erfordert, Opfern von Tieren, Zellen von Organen zu isolieren. Es erfordert auch, Isolierung des Blutes von kleinen Tieren, die schwierig durchzuführen ist. Die letztere Methode ist recht schnell, kann bequem mit kleinen Mengen von Blut und ist nicht abhängig von bestimmten Effektor-Funktionen, wie z.B. zytolytischen Aktivität. MHC-Tetramers sind ein ideales Werkzeug um Antigen-spezifischen TCRs zu erkennen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll gleichzeitig Antigen-spezifischen CTLs für die immundominante Peptide des viralen Vektors VSV-GP (LCM-GP, VSV-NP) transgene (OVA, HPV 16 E7 eGFP) durch MHC zu erkennen, und ich Tetramer Färbung und Flow Cytometry. Färbung ist möglich direkt aus Blut oder aus einzelnen Zellsuspensionen Organe, wie Milz. Blut oder einzelne Zellsuspensionen von Organen sind mit Tetramers inkubiert. Nach der Färbung mit Antikörper gegen CD3 und CD8 sind Antigen-spezifischen CTLs durch Durchflusszytometrie quantifiziert. Optional können Antikörper gegen CD43, CD44, CD62L oder andere enthalten, um den Aktivierungsstatus der Antigen-spezifische CD8 bestimmen werden+T Zellen und zwischen naiv und Effektor Zellen unterscheiden.
Introduction
Das Ziel dieser Methode ist, zu beurteilen, die Häufigkeit der zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Antworten, (mehrfach-) Antigene in der Maus durchflusszytometrischen Analyse ohne zeitraubende Peptid-Stimulation. Diese Methode analysiert die Phänotyp und Antigen Spezifität der CTL Teilmengen, in eine einheitliche Färbung. Wir optimieren die Major Histocompatibility Complex ich (MHC ich) Tetramer Färbeprotokoll zur Wirksamkeit des neuen Impfstoffs Ansätze wie VSV-GP, eine neue Variante des vesikuläre Stomatitis Virus (VSV), zu analysieren, wo das Glykoprotein G des VSV durch ersetzt wurde die Glykoprotein GP der Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus (LCM)1,2. Neben der humoralen Antwort ist eine wichtige Auslesen von der Wirksamkeit eines Impfstoffs die Induktion einer CTL-Antwort gegen eine oder mehrere Antigene. Da die Konsistenz und Haltbarkeit der zellulären Antwort in diesem Zusammenhang wichtig sind, ist es günstig, Kinetik der CTL-Antworten vom gleichen Tier zu überwachen. Dies führt auch zu einer Reduzierung der Tierzahlen, ein wichtiger Aspekt zu den Grundsätzen der “3R”3. Daher ist die Analyse von weniger als 20 µL Blut für diesen Zweck optimal.
Tetramers entstanden in den späten 90er Jahren4 und wurde ein wichtiges Instrument im Bereich der T-Zell-Immunologie. Tetramers sind Eindringmittel beschriftet komplexe von vier MHC ich / Peptid Moleküle, die an TCR, für ein einzelnes Peptid spezifisch binden. Heutzutage können sie entweder fertige5, individuell bestellten gekauft werden kostenlos an die NIH Tetramer Core Facility Emory University6 oder in der Lab-7produziert. MHC I und II Tetramers sind vorhanden, , d. h. für CD8+ und CD4 bzw.+ T-Zellen. Die Potenz der Tetramer Färbung liegt in Zeitersparnis, eher einfach und leicht zu8 Protokolle und Empfindlichkeit9zu standardisieren. Auch wenn mit Blut arbeiten, Tiere brauchen nicht geopfert werden und minimalen Probenmengen sind erforderlich. Eine Messung beschränkt sich nicht auf ein einziges Antigen, aber mehrere Antigene in einer Färbung bei der Kombination von Tetramers mit verschiedenen Fluorophore konjugiert analysiert werden können. Neu entdeckte Antigene, z.B. von Peptid-Bildschirme, können leicht Tetramers gegründet und zur Quantifizierung der T-Zell-Teilmenge verwendet werden.
Tetramer Färbung geben Auskunft über CTL-Funktionalität (dh., Produktion von Zytokinen, Effektor-Funktionen), nicht aber nur Spezifität. Informationen über T-Zell-Funktionalität, intrazelluläre Zytokin Färbung (ICS) oder Enzyme Linked Immuno Spot (ELISpot) Assay muss gewinnen durchgeführt,8,10. Tetramer Färbung und ICS/ELISpot, aber sind nicht überflüssig, aber einander ergänzen. In-vitro-Stimulation zur Produktion von Zytokinen für ICS/ELISpot induzieren ändert den ursprünglichen T-Zell-Phänotyp. Tetramer Färbung, lässt die T-Zelle dagegen unberührt; das ursprüngliche Erscheinungsbild erhalten bleibt und analysiert werden kann. Außerdem ist ein weiterer großer Vorteil des Tetramers Färbung mit magnetischen Sortier- und Anreicherung von Antigen-spezifischen Zellen11kombiniert werden kann. Dies ermöglicht die Analyse der seltenen Populationen sowie die Kultivierung der sortierten Zellen mit definierten Antigen-Besonderheiten – ein Feature, das nicht mit anderen Methoden möglich sein.
Mit der hier beschriebenen Protokoll, Tetramer Färbung, sowie ICS/ELISpot kann von einem Organ durchgeführt werden, da nur sehr wenig Material (Blut: 20 µL; Milz: 1 x 106 Zellen) ist erforderlich für das Tetramer zu beflecken. Jedoch abhängig von der Häufigkeit der Antigen-spezifische Zellen von Interesse, die Stärke der jeweiligen TCR und experimentellen Kontext, die Höhe der Zellen erforderlich müssen möglicherweise hochskaliert werden oder magnetische Anreicherung könnte angewendet werden müssen.
Tetramers sind weit verbreitet, zum Beispiel zur Bewertung der Effektivität von Impfstoffen (Antitumor-)12,13,14,15 oder Immuntherapie16,17, phänotypische Analyse und räumliche Lokalisierung von antigenspezifischen T Zelle Teilmengen18,19,20,21,22,23. Die hier beschriebene Methode eignet sich für Studien, die darauf abzielen, die Quantifizierung und phänotypische Analyse der murinen Antigen-spezifische CD8 sind+ T-Zellen in ihrer Analyse auf eine schnelle und bequeme Weise.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tetramer Färbung ist eine eher einfache und unkomplizierte Protokoll, Phänotyp und Peptid Besonderheit der T-Lymphozyten zu analysieren. Die Verwendung von Blut für die Analyse, wie hier beschrieben ist minimal invasiv und ermöglicht die kontinuierliche Überwachung, zum Beispiel in Studien der Impfung. Auf dem Gebiet der Impfung ist die Quantifizierung der Vektor und Antigen-spezifische Antworten von Interesse, als Vektor-spezifische Reaktionen eine effektive Immunantwort gegen den Impfstoff Antigen28behindern könnten. Bemerkenswert ist, dass mit dem hier beschriebenen Protokoll beider Völker gleichzeitig in einem einzigen Tetramer Färbung, quantifiziert werden können wodurch Färbung Variabilität und Probe Beträge. Ein paar Schritte müssen jedoch sorgfältig durchgeführt werden, um korrekte Messung und zuverlässige Daten zu gewährleisten. Wenn Blut aus der Vene Rute für die Analyse verwenden, sollte man die Tiere um Vasodilatation24induzieren Vorwärmen sicherstellen. Dabei ausreichend Blut in kurzer Zeit eingesammelt werden kann, reduziert Stress auf die Tiere und die Analyse ist viel besser, im Vergleich zu wenn das Blut langsam gesammelt werden. Auch nach der Probenentnahme (Blut oder Organe), direkte Färbung empfiehlt sich falsch negative Ergebnisse wegen TCR Downregulation zu vermeiden. Dies gilt auch für alle weiteren Schritte: das Verfahren sollte nicht unterbrochen werden und alle Waschschritte reduziert auf die Mindestzahl (wie erwähnt im Protokoll). Um die richtige Färbung zu gewährleisten, sollte darauf alle Lösungen und Proben vor und nach der Inkubation Vortex geachtet werden. Dies ist besonders wichtig vor der Befestigung der Proben zur Verklumpung der Zellen zu vermeiden.
In Bezug auf das Protokoll zu ändern, können andere Oberflächenmarker und Tetramers werden, je nach dem Ziel der Analyse verwendet. Alle Reagenzien müssen jedoch dann optimal in Kombination mit der ganzen Färbung Panel titriert werden. Für einige von den hier angegebenen Tetramers, Optimierung ergab, dass wir die vom Hersteller empfohlene Verdünnung erhöhen können (01:10 empfohlen, optimiert, 01:25) (Tabelle 1). Um spektrale Überlappung zu kompensieren, können die Entschädigung Perlen statt gefärbten Zellen verwendet werden. In Bezug auf die Wahl der Tetramer-gekoppelten Fluorochrom sollte man vorsehen um helle Fluorochromes verwenden da diese Erkennung – erleichtert, vor allem, wenn das Signal zu schwach ist. Als Dolton und Kollegen29, wir bevorzugen PE – oder APC-gekoppelten Tetramers, die perfekt in eine einheitliche Färbung und CD8 kombinierbar sind+ T Zellen mit einer einzigen Antigen-Spezifität können schön werden erkannt (Abbildung 2). Hinsichtlich Temperatur und Inkubation Zeiten gibt es eine Vielzahl von Tetramer Färbung Bedingungen. In unserem Optimierungsprozess wir dieses Thema angesprochen und Tetramer Färbung bei unterschiedlichen Bedingungen (z.B. 4 ° C, Raumtemperatur oder 37 ° C) durchgeführt. Aus den Ergebnissen wird empfohlen, um für 20 min bei 37 ° C zu beflecken, die in Übereinstimmung mit der Literatur30,31. Längere Inkubation sollte vermieden werden, da dies zu Internalisierung von Tetramer30 und falsch negativen Ergebnissen führen kann.
Die Wahl der richtigen Antikörper für die Erkennung von CD8+ Zellen ist ein weiteres wichtiges Thema, die durchdachte (und potenziell angepasst) hat. Dies ergibt sich aus der Tatsache, dass bestimmte Antikörper Anti-CD8-Block Bindung des Tetramers, TCR in menschlichen32 sowie Maus33 Proben Klone. Für unsere Tetramer Färbeprotokoll, ausgewählt wir Klon 53 – 6,7 für murine CD8 Fleck+ Zellen – ein Klon die nicht blockiert, sondern vielmehr verstärkt Tetramer Färbung.
Tetramer Färbung ist eher unkompliziert, wenn prominente Immunantworten auf dem Höhepunkt der T-Zell-Antwort, zum Beispiel zu analysieren. Jedoch möglicherweise Bevölkerungen, die ein bisschen mehr “problematisch” sind. Solche Beispiele sind Zellen spezifisch für geringe Affinität Antigene (Tumor, selbst), zuletzt aktivierten Zellen nachträglich nach unten reguliert ihre Rezeptoren oder seltenen Zelle Teilmengen (z.B.. -naive Vorstufe oder Speicher Zellpopulationen). In diesen Fällen müssen die klassischen Tetramer Färbeprotokoll verbessert oder mit anderen Methoden kombiniert werden. Zum Beispiel Protein Kinase-Inhibitor (PKI) Dasatinib hemmt TCR Internalisierung und vor Tetramer Färbung enthalten sein könnte. Tetramers können auch durch Anti-Fluorochrom unconjugated primäre Abs nach Tetramer Färbung einschließlich stabilisiert werden. Darüber hinaus kann die Fluoreszenzintensität durch Zugabe von einem zweiten Anti-Ab Fluorochrom konjugiert Ab29,34,35,36erhöht werden. Wir die Bedingungen selektiv für die Tetramers angegeben in diesem Protokoll optimiert und PKI oder zusätzliche Abs nicht enthalten. Die optimalen Bedingungen müssen jedoch für jeden anderen Tetramer individuell angepasst werden. Im Hinblick auf seltene Populationen Tetramer Färbung möglicherweise mit magnetischen Anreicherung11kombiniert werden.
Zur Erleichterung und FACS Analyse der Tetramer Färbung zu validieren, sollten negativ-und Positivkontrollen einbezogen werden. Als Negativkontrolle färben wir immer Zellen einer naiven Maus des gleichen Stammes mit unseren Tetramer von Interesse. Alternativ können Proben mit Tetramers mit irrelevanten Peptide, aber mit der gleichen Fluorochrom als Tetramer von Interesse befleckt werden. Diese Kontrollen sind unerlässlich, um falsche positive Signale ausschließen z.B.., von sterbenden Zellen stammen. Darüber hinaus empfiehlt es sich, einen lebenden/Toten Fleck, wie Propidium Jodid (PI) enthalten. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn Zellen nicht direkt nach Isolierung gefärbt sind. Eine weitere Strategie zur Autofluoreszenz Hintergrund entfernen möglicherweise mehrere T-Zell-Marker in einem Kanal aufnehmen. Durch den Ausschluss Zellen positiv in diesem Kanal, können T-Zell-Populationen ausgeschlossen werden. Als Positivkontrolle kann eine Probe von einem OT-1 Maus für OVA Tetramer, zum Beispiel verwendet werden. Dies muss für andere Tetramers individuell gewählt werden (z. B.., Probe von einer Maus, die mehrmals geimpft wurde). Gleich anderen37, beobachten wir auch eine Down-Regulierung der CD8-Rezeptor bei CTL Aktivierung am 7. Tag der Effektor T-Zell-Antwort. Daher, um aktivierte Tetramer+ -Effektor T-Zellen zu vermeiden, empfehlen wir, dieniedrige CD8-Zellen in die Analyse einbeziehen (zumindest wenn die Effektor-Phase messen).
Die Qualität und die Menge an Informationen, die man aus diesem Protokoll abrufen kann ist das Wissen über das Antigen untersucht werden, die Verfügbarkeit und die Besonderheit des Tetramer und die Qualität der FACS-Maschine (Anzahl der Laser und Detektoren erhältlich) abhängig. Arbeiten mit Tieren Proben ist Variation der Immunantwort natürlich und unvermeidlich. Um aussagekräftige Ergebnisse von Tetramer Färbung zu erhalten, sollten daher mindestens 3 – 5 Tiere analysiert werden. Wenn getan, wird das hier beschriebene Protokoll zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse geben (beispielhafte ergeben sich aus einem Experiment finden Sie in der Zusätzlichen Tabelle 1). Wie bereits erwähnt, diese Methode ist perfekt geeignet, um den Phänotyp und Antigen-Spezifität der CD8 quantifizieren+ T-Zellen (Abbildung 3, 4; Zusätzliche Abbildung 1), nicht nur in der Maus sondern auch beim Menschen. Jedoch Funktionen zum analysieren CD8+ T-Zell-Effektor, wie Granzym-induzierte Zelltod, ICS und/oder ELISpot durchgeführt werden müssen. Allerdings sollte man im Hinterkopf behalten, dass T-Zell-Funktionen, gemessen durch in-vitro-Stimulation nicht die tatsächliche Situation in-vivo darstellen könnte. In vivo eine suppressive Umgebung T Zellfunktionen verhindern möglicherweise die in-vitro-gemessen werden.
Auf seine eigene, Tetramer Färbung bietet nicht alle Informationen, sondern es entwickelt, um eine wesentliche Methode zur T-Zell-Antworten zu charakterisieren und zu quantifizieren T Zelle Teilmengen in-vitro-in einer sehr sensibel38geworden. Tetramers kann nicht nur verwendet werden, bestimmte Teilmengen zu quantifizieren, sondern auch zu isolieren die39, durch in-situ Hybridisierung19,20 zu lokalisieren und zu studieren Low-Affinität Antigene, wie z.B. Tumor-assoziierten40, 41. seit der Entdeckung des Tetramer Technologie4Tetramer Färbung ist ein wesentliches Instrument in der T-Zell-Analyse und das Anwendungsspektrum geworden.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde gefördert vom Österreichischen Wissenschaftsfonds FWF (Projektnummer P 25499-B13) und der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm unter Vereinbarung Nr. 681032 gewähren. Die folgende Reagenz erhielt durch das NIH Tetramer Core Facility: Klasse I MHC-Tetramer für vesikuläre Stomatitis Virus Nucleoprotein (RGYVYQGL).
Materials
| Safety cabinet class 2 | VWR | LBCP302411030 | |
| Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) | BD | 338962 | |
| Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) | Fisher Scientific Co. L.L.C. | NC0887833 | |
| Binocular microscopes, VisiScope 100 | VWR | 630-1553 | |
| Vortex mixer | Phoenix Instrument | RS-VA 10 | |
| Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) | Hettich | 5660 | |
| Sterile Scalpel Blades Nr. 10 | Braun | BB510 | |
| Cell strainer 40 µm | Sigma | CLS431750 | |
| Cell strainer 70 µm | Sigma | CLS431751 | |
| Neubauer counting chamber | VWR | 630-1506 | |
| Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) | Eppendorf | 4924000037, 4924000061, 4924000088 | |
| Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Biozym | 770050, 770200, 770400 | |
| Pipet Boy | Integra | 155 000 | |
| Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Multistep Pipette, HandyStep S | BRAND | 705110 | |
| 12.5 ml Combitips for Multistep Pipette | BrandTech Scientific | 702378 | |
| Microvette CB 300 K2E | Sarstedt | 16.444 | |
| Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) | Sarstedt | 72.692.005, 62.547.254 | |
| FACS tubes (non-sterile) | Szabo Scandic | BDL352008 | |
| PBS | Lonza | LONBE17-516F | |
| Heat-inactivated FCS | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Formaldehyde | Roth | 4979.1 | |
| Sodium azide | Roth | K305.1 | |
| PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex | BD | 560591 | Clone 17A2; Lot # 7235504 |
| Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a | BD | 558106 | Clone 53-6.7; Lot # 5058904 |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD | 560469 | Clone 53-6.7; Lot # 5205945 |
| FITC anti-mouse CD43 | BioLegend | 121206 | Clone 1B11; Lot # B233778 |
| PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 | BD | 553135 | Clone IM7; Lot # 85660 |
| APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L | BD | 560514 | Clone MEL-14; Lot # 7215801 |
| OVA-tetramer/APC | MBL | TB-5001-2 | SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008 |
| VSV NP-tetramer/PE | MBL | TS-M529-1 | RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007 |
| EGFP-tetramer/PE | MBL | TS-M525-1 | HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004 |
| LCMV-GP-tetramer/APC | MBL | TB-5002-2 | KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006 |
| HPV 16 E7-tetramer/APC | MBL | TB-5008-2 | RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003 |
Referencias
- Tober, R., et al. VSV-GP: a potent viral vaccine vector that boosts the immune response upon repeated applications. Journal of virology. 88 (9), 4897-4907 (2014).
- Muik, A., et al. Re-engineering vesicular stomatitis virus to abrogate neurotoxicity, circumvent humoral immunity, and enhance oncolytic potency. Cancer Reseaerch. 74 (13), 3567-3578 (2014).
- Eales, L. J., Farrant, J., Helbert, M., Pinching, A. J. Peripheral blood dendritic cells in persons with AIDS and AIDS related complex: loss of high intensity class II antigen expression and function. Clinical and Experimental Immunology. 71, 423-427 (1988).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- . Tetramers and Monomers Available from: https://www.mblintl.com/products/research/monomer-tetramers/filter/product_type/monomer (2016)
- Wolfl, M., et al. Quantitation of MHC tetramer-positive cells from whole blood: evaluation of a single-platform, six-parameter flow cytometric method. Cytometry A. 57 (2), 120-130 (2004).
- Burrows, S. R., et al. Peptide-MHC class I tetrameric complexes display exquisite ligand specificity. The Journal of Immunology. 165 (11), 6229-6234 (2000).
- Sims, S., Willberg, C., Klenerman, P. MHC-peptide tetramers for the analysis of antigen-specific T cells. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 765-774 (2010).
- Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. The Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Xie, Y., et al. A novel T cell-based vaccine capable of stimulating long-term functional CTL memory against B16 melanoma via CD40L signaling. Cellular & Molecular Immunology. 10 (1), 72-77 (2013).
- Nanjundappa, R. H., Wang, R., Xie, Y., Umeshappa, C. S., Xiang, J. Novel CD8+ T cell-based vaccine stimulates Gp120-specific CTL responses leading to therapeutic and long-term immunity in transgenic HLA-A2 mice. Vaccine. 30 (24), 3519-3525 (2012).
- Bowers, E. V., Horvath, J. J., Bond, J. E., Cianciolo, G. J., Pizzo, S. V. Antigen delivery by alpha(2)-macroglobulin enhances the cytotoxic T lymphocyte response. Journal of Leukocyte Biology. 86 (2), 1259-1268 (2009).
- Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. The Journal of Immunology. 88 (20), 12006-12016 (2014).
- Sakai, K., et al. Dendritic cell-based immunotherapy targeting Wilms’ tumor 1 in patients with recurrent malignant glioma. Journal of Neurosurgery. 123 (4), 989-997 (2015).
- Rosaely, C. G., et al. Immune responses to WT1 in patients with AML or MDS after chemotherapy and allogeneic stem cell transplantation. International Journal of Cancer. 138 (7), 1792-1801 (2016).
- Shane, H. L., Reagin, K. L., Klonowski, K. D. The Respiratory Environment Diverts the Development of Antiviral Memory CD8 T Cells. The Journal of Immunology. , (2018).
- Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. The Journal of Visualized Experiments. (127), e56130 (2017).
- De Vries, I. J. M., et al. In situ detection of antigen-specific T cells in cryo-sections using MHC class I tetramers after dendritic cell vaccination of melanoma patients. Cancer Immunology Immunotherapy. 56 (10), 1667-1676 (2007).
- Tan, H. X., et al. Induction of vaginal-resident HIV-specific CD8 T cells with mucosal prime-boost immunization. Mucosal Immunology. , (2017).
- Huang, H., et al. CD8(+) T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), (2017).
- Hensel, M. T., et al. Selective Expression of CCR10 and CXCR3 by Circulating Human Herpes Simplex Virus-Specific CD8 T Cells. Journal of Virology. 91 (19), (2017).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- San Jose, E., Borroto, A., Niedergang, F., Alcover, A., Alarcon, B. Triggering the TCR complex causes the downregulation of nonengaged receptors by a signal transduction-dependent mechanism. Immunity. 12 (2), 161-170 (2000).
- Dietrich, J., Hou, X., Wegener, A. M., Geisler, C. CD3 gamma contains a phosphoserine-dependent di-leucine motif involved in down-regulation of the T cell receptor. EMBO Journal. 13 (9), 2156-2166 (1994).
- Schone, D., et al. Immunodominance of Adenovirus-Derived CD8(+) T Cell Epitopes Interferes with the Induction of Transgene-Specific Immunity in Adenovirus-Based Immunization. Journal of Virology. 91 (20), (2017).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide–MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Whelan, J. A., et al. Specificity of CTL Interactions with Peptide-MHC Class I Tetrameric Complexes Is Temperature Dependent. The Journal of Immunology. 163 (8), 4342-4348 (1999).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide–MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Denkberg, G., Cohen, C. J., Reiter, Y. Critical role for CD8 in binding of MHC tetramers to TCR: CD8 antibodies block specific binding of human tumor-specific MHC-peptide tetramers to TCR. The Journal of Immunology. 167 (1), 270-276 (2001).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. The Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 335-346 (2000).
- Tungatt, K., et al. Antibody stabilization of peptide-MHC multimers reveals functional T cells bearing extremely low-affinity TCRs. The Journal of Immunology. 194 (1), 463-474 (2015).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. Journal of Immunological Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Rius, C., et al. Peptide-MHC Class I Tetramers Can Fail To Detect Relevant Functional T Cell Clonotypes and Underestimate Antigen-Reactive T Cell Populations. The Journal of Immunology. 200 (7), 2263-2279 (2018).
- Xiao, Z., Mescher, M. F., Jameson, S. C. Detuning CD8 T cells: down-regulation of CD8 expression, tetramer binding, and response during CTL activation. The Journal of Experimental Medicine. 204 (11), 2667-2677 (2007).
- McMichael, A. J., O’Callaghan, C. A. A New Look at T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 187 (9), 1367-1371 (1998).
- Hunsucker, S. A., et al. Peptide/MHC tetramer-based sorting of CD8(+) T cells to a leukemia antigen yields clonotypes drawn nonspecifically from an underlying restricted repertoire. Cancer Immunology Research. 3 (3), 228-235 (2015).
- Pittet, M. J., et al. Ex vivo analysis of tumor antigen specific CD8+ T cell responses using MHC/peptide tetramers in cancer patients. International Immunopharmacology. 1 (7), 1235-1247 (2001).
- Cohen, C. J., et al. Isolation of neoantigen-specific T cells from tumor and peripheral lymphocytes. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3981-3991 (2015).
