Локус пятно — небольшое скопление нейронов, участвующих в различных физиологических процессов. Здесь мы описываем протокол для подготовки разделов мозга мыши для исследования белков и металлов в этом ядре.
Локус пятно (LC) является основным центром норадреналина, производства нейронов, которые модулируют ряд физиологических функций. Структурные или функциональные нарушения LC воздействие нескольких регионов мозга, включая кору, гиппокамп и мозжечке и может способствовать депрессии, биполярного расстройства, тревога, а также болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. Эти заболевания часто связаны с металлическими дисбаланса, но лишь частично понимают роль металлов в LC. Морфологические и функциональные исследования LC необходимо лучше понять человека патологий и вклад металлов. Мышей являются широко используется Экспериментальная модель, но мыши LC небольшие (диаметром ~0.3 мм) и трудно определить для не эксперт. Здесь мы опишем шаг за шагом протокол на основе иммуногистохимия локализовать ЛК в мозг мыши. Допамин β-гидроксилазы (дуг) и в качестве альтернативы, тирозин гидроксилазы (TH), оба фермента, сильно выражена в ЛК, используются в качестве иммуногистохимических маркеров в срезах головного мозга. Участков, прилегающих к LC-содержащие разделы могут использоваться для дальнейшего анализа, включая гистологию для морфологических исследований, метаболических тестирования, а также металлических изображений рентгеновской микроскопии флуоресцирования (XFM).
Локус пятно (LC) является важным регионом в ствол головного мозга и основных сайт производства норадреналина (NE)1. LC отправляет прогнозы во всем мозг2 коры, гиппокамп и мозжечке3 и регулирует основные физиологические процессы, включая Циркадный ритм4,5, внимания и памяти6, стресс,7,8когнитивные процессы и эмоции9,10. Дисфункция LC был вовлечен в неврологической и нервно-психических расстройств11, включая Паркинсона болезнь12,13,14, Альцгеймера болезнь14, депрессии15 ,16,17, биполярное расстройство18,19и тревоги20,21,,2223, 24. Учитывая эти роли, анализ LC имеет решающее значение для изучения ее функции и дисфункции.
Мышей широко используются для исследования процессов физиологического и патофизиологические. Из-за их малого размера мышь LC имеет средний диаметр ~ 300 мкм, привело к затруднению обнаружения структуры. При резании мозга, LC легко могут быть пропущены в коронковой или сагиттального секций. Имеющиеся исследования, описывающие Идентификация ЛК в животных не дают пошаговые протокол что non эксперт может следовать за1,25. Таким образом предложить руководство по локализации LC, мы описать протокол, который мы разработали, чтобы найти этот регион в мозг мыши для нескольких приложений (рис. 1, Рисунок 2, рис. 3). Протокол применяется тщательно контролируемых мозга секционирование и Иммуногистохимическое определение DBH26,27, или альтернативно й24, оба фермента высокообогащенного в LC28. После LC расположен по иммуногистохимия, фрагментов прилегающих мозга может использоваться для дальнейших исследований, в том числе Морфологические и метаболический анализ, а также металлических изображений исследования через рентгеновской флуоресценции микроскопии (XFM)29. Мы описываем XFM в качестве примера в настоящем Протоколе (рис. 3).
Правильной ориентации образца представляет собой решающий шаг в этом протоколе. Потому что мы используем анатомические особенности поверхности спинного мозга, чтобы найти LC (граница между мозжечка и уступает colliculus), важно, что в разделах быть выровнены правильно. Это требует ухода в пр…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Абигаэль Muchenditsi для поддержания колонии мыши. Использование передовых Фотон источника в Аргоннской национальной лаборатории была поддержана в Министерство энергетики США, управление науки, управление основные энергии наук, по контракту №: де-AC02-06CH11357. Мы благодарим Антипова Ольга и д-р Стефан Vogt для пользователей поддержки и помощи на источнике Advanced Фотон. Эта работа финансировалась национального института здравоохранения грант 2R01GM101502 в SL.
Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
Microscope | Pascal | LSM 5 | |
Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
Pencil brush | |||
Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
T pins | Office Depot | 344615 | |
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 |