マウスの脳、青斑核の局在
Summary
斑は、様々 な生理学的なプロセスに関わるニューロンの小さいクラスターです。ここでは、蛋白質やこの核で金属の研究のマウスの脳のセクションを準備するためのプロトコルについて述べる。
Abstract
軌跡青斑核 (LC) は、ノルエピネフリン生理機能の数を調節する神経細胞の生産の主要なハブです。液晶の構造的または機能的な異常皮質、海馬、小脳などいくつかの脳領域に影響を与えるし、うつ病、双極性障害、不安、パーキンソン病、アルツハイマー病に貢献するかもしれない。これらの疾患はしばしば金属 misbalance に関連付けられている、lc における金属の役割は部分的にしか理解されています。LC の形態と機能の研究は、人間の病態と金属の貢献を理解する必要です。マウスは、広く使用されている実験モデル、マウス液晶が小さい (~0.3 mm 径) と非専門家を特定するは難しい。ここでは、マウスの脳で LC をローカライズする段階的な免疫組織化学ベースのプロトコルについて述べる。ドパミン-β-水酸化酵素 (DBH)、およびまた、チロシンヒドロキシラーゼ (TH)、両方の酵素を液晶で高発現は、脳切片での免疫組織化学的マーカーとして使用されます。X 線蛍光顕微鏡 (XFM) による詳細な分析、組織形態学的研究、代謝性のテストと同様の金属のイメージングを含む LC を含むセクションに隣接するセクションを使用できます。
Introduction
軌跡青斑核 (LC) は、脳幹とノルエピネフリン (NE) 生産1の主要なサイトで重要な地域です。LC 脳2全体の予測を大脳皮質、海馬、小脳3に送信し、概日リズム4、5注意と記憶6を含む主要な生理的プロセスを調節します。7、認知過程8、および感情9,10を強調します。LC の機能不全は、神経疾患、精神神経疾患11を含むパーキンソン病12,13,14アルツハイマー病1415 うつ病に関与しています。 ,16,17, 双極性障害18,19, そして不安20,21,22,23,24します。 これらの役割を考えると、LC の分析はその機能と機能障害を勉強することが重要です。
マウスは、生理学的および病態生理学的プロセスの研究に広く使用されます。サイズが小さいためマウス LC は ~ 300 μ m、構造を見つける難しさにつながるの平均直径を有する。脳の断面、中に、LC は、コロナや矢状のセクションで簡単に逃したことが。動物で LC の同定を記述する利用可能な研究は、ステップバイ ステップのプロトコルを提供していない非専門家が1,25を従うことができます。したがって、LC のローカリゼーションのためのガイダンスを提供するいくつかのアプリケーション (図 1, , 図 2図 3) マウス脳のこの領域を検出する開発したプロトコルについて述べる。プロトコルは、胸高直径26,27, または日24、注意深く制御された脳区分および免疫組織化学的検出 LC28の高濃縮両方の酵素を適用されます。LC を免疫組織化学で見つかったら、隣接する脳スライスはさらなる研究、形態および代謝解析、x 線蛍光顕微鏡 (XFM)29を介して金属のイメージング研究などに使用できます。このプロトコル (図 3) の例として XFM について述べる。
Protocol
動物の研究は、ジョンズ ・ ホプキンス大学動物ケアと (ACUC) を使用するプロトコル番号 M017M385 によって承認されました。 1. 脳スライス 固定、3% イソフルランのアプリケーションでマウスを麻酔します。 イソフルランの滴でコットン ボールを浸すし、15 mL 遠心チューブ内に配置します。動物の鼻にチューブを置き、イソフルランを吸い込むことができます…
Representative Results
(Cu、Fe、Zn, Mn) など金属恒常性の変化は、神経学的疾患、LC34,35の変化などで多く観察されます。したがって、脳内金属のレベルを決定する疾患のメカニズムを理解するために必要です。記述のプロトコルを使用して生成された脳のセクションは、Cu と LC で他の金属のレベルを定量化し、LC 以外の地域のレベルにそれらを比?…
Discussion
このプロトコルの重要なステップは、供試体を正しく方向づけます。LC (小脳と下丘間の境界) を検索する脳の背側表面の解剖学的特徴を使用している我々 は、ためには、セクションが正しく位置合わせされることが重要です。マウス脳スライサー行列に脳を正しく設定に注意が必要です。核の欠落を回避する LC に前部と後部に 〜 500 μ m より多くの組織を切断をお勧めします。最も一般的な…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 はマウス コロニーの維持のための Abigael Muchenditsi を感謝します。アルゴンヌ国立研究所で高度な光子源の使用は、米国エネルギー省科学局オフィスの基本的なエネルギー科学、契約番号によって支えられた: デ AC02 06CH11357。ユーザー サポートや高度な光子源援助、オルガ Antipova と博士ステファン Vogt に感謝します。この作品は、SL に国立衛生研究所の助成金 2R01GM101502 で賄われていた。
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
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Citar este artículo
Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M., Washington-Hughes, C., Muchenditsi, A., Maxey, E., Lutsenko, S. Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (145), e58652, doi:10.3791/58652 (2019).