재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

1. 곤충 준비 몇 시간 동안 또는 CO2 를 2 분 노출 4 ° C에서 그들을 재미을 누른 다음 주사 전에 4 ° C에서 모기를 anesthetize. 감기 주사 전에 h 4 ° C 2\u20123에서 파리 anesthetize. 모기와 파리는 성관계를 산란 응답 변수 인지 확인 하십시오.참고: 모기 anesthetization 메서드는 종 및 변형에 따라 다릅니다, 그리고 예를 들어, Culex Aedes aegypti 보다 차가운 anesthetization에서 훨씬 빨리 복구 및 따라서 CO2 최저 바람직합니다. 얼음, 신중 하 게 단계 모기 또는 파리 ventrally 그들을 부드러운 집게를 사용 하 여 노출 현미경 슬라이드 ~0.5 c m 간격에. 표준 슬라이드 6 모기의 두 행을 저장할 수 또는 6-7 집 파리. 모기 또는 슬라이드 처리를 돕기 위해 파리의 명확한 슬라이드의 왼쪽 이나 오른쪽 끝에 1-1.5 c m의 공간을 남겨 주세요. 주입에 대 한 준비까지 큰 접시에 4 ° C에서 준비 된 곤충의 슬라이드를 계속.참고: Petri 접시 뚜껑을 통해 구멍을 드릴 때 상한 공기 변위에 의해 방해 되 고에서 곤충을 방지 도움이 됩니다. 몇 접시 바닥에 확보 유리 모 세관에 슬라이드 배치 페 트리 접시에서 제거를 쉽게 것입니다. 2. 곤충 주입 Estep 외 에 설명 된 대로 dsRNA를 준비 5 와 Sanscrainte 외. 9. 만약, 오염 물질의 무료 dsRNA 수 측정할 수 260 nm로260 × 희석 비율 × 40 μ g/mL에서 계산 RNA 농도에서 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여. 진정 표 또는 얕은 얼음 양동이 현미경 및 microinjector를 해 부 하도록 설정 냉 취 모기와 파리 (1.1-1.3 단계 및 그림 1참조)에 주사를 수행. 유리 모 세관 바늘 끌어당기는 사람와 좋은 팁을 당겨 (설정: 히터 = 15 단위, 솔레노이드 = 4 A).주: 제조업체의 세부 사항에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오. 모 세관 바늘을 날카로운 포인트를 생산 하는 집게의 쌍을 곤란 하 게 하 여 제조업체의 지침과 휴식 바늘 팁에 의하여 microinjector에 넣으십시오.참고: 제안된 바늘 오프닝 크기는 모기에 대 한 ~ 150 µ m 및 집 파리에 대 한 ~ 250 µ m입니다. 원하는 배달 볼륨에 대 한 microinjector를 설정 합니다. ~ 50 nL aliquots에서 초승달 모양 움직임은 쉽게 관찰 하 고 모기 microinjections에 대 한 권장. 가능한 경우, 빠른 주입 설정 가능 작성 및 추방 nuclease 무료 물 3 번 바늘을 씻어. 주입 농도 100\u2012150 nL 모기에 대 한 원하는 복용량 그리고 500 nL 제공할 것입니다 같은 제공에 원하는 집 파리에 대 한 복용량에 대 한 솔루션을 준비 합니다.참고: 제안 초기 복용량: 1 µ g 대는 각 모기 및 각 집 파리5,95 µ g. 선택적으로 모기, Rhodamine B (시각화에 도움) 3.0 µ g/mL의 최종 농도에 솔루션을 추가 합니다.참고: 염료 복 부/가슴 교차로에서 복 부 표면에 거의 분명 표 피를 통해 주입 후의 핑크 색상으로 명확 하 게 표시 됩니다. 하 주사 (파라핀 필름의 조각) 등 깨끗 한 표면에 유리 바늘으로 공기에서 빠는 없이 솔루션의 3-4 µ L 플라스틱 액체는 바늘에서 분배 하 여 섬세 한 작업와이 퍼와 물방울을 닦아 부드럽게 시작 될 때까지 반복 해 서 넣기 버튼을 눌러.참고: microinjectors의 일부 모델 필요 하지만 백필 주사기, 인젝터 재료의 테이블에서 에서 참조 하지 않습니다. 울트라 벌금 포인트 마커를 사용 하 여 해시 마크 ~ 1 mm 떨어져 시작 액체 초승달 모양에서 바늘 칼을 그립니다. 이 초승달 모양 움직임을 시각화에 도움이 되며 솔루션은 주입 동안 모기를 입력 확인. 진정 테이블 또는 얼음 (그림 1)에 바늘에서 모기 또는 파리 (로 단계 1.2-1.3에서에서 준비)의 슬라이드를 설정 합니다. 확인 현미경에서 그의 시야는 넓은 바늘에 솔루션 초승달을 볼 정도로. 모기에 대 한 mesokatepisternum (그림 2A)의 중간 1/3로 바늘을 정렬 하 고 반대편에 배치 집게와 바늘에 대 한 모기를 보강 하는 동안 부드럽게 찌르는 바늘 팁 사용 하 여 표 피는 microinjector 마이크로 미터입니다. 집 파리에 대 한 mesopleuron (그림 2B)와 바늘을 정렬 하 고 바늘에 대 한 비행을 보강 하면서 부드럽게 펑크 바늘 팁과 표 피. 부드럽게 모기에 바늘을 슬라이드 또는 끝 중간 선 통과 될 때까지 신체를 비행.참고: 곤충에서 주입 된 액체 구슬에서 결과 수시로 너무 얕은 바늘을 삽입 (단계 2.15 참조). 원하는 양의 액체 주입 되어 때까지 바늘에 액체 초승달의 움직임을 보면서, 넣기 버튼을 눌러. 모기에 대 한 경우 50.6 nL aliquots로 설정, ~ 100에 대 한 2 X를 눌러 nL 또는 3 배 ~ 150 nL. ~ 500 nL 주입 되어까지 넣기 버튼을 눌러 집 파리에 대 한 (즉, 69 nL aliquots와 7 X 483 눌러 nL). 초승달 모양 이동 하지 않으면 천천히 모기 슬라이드 또는 초승달 모양 운동에 대 한 보고 하는 동안 바늘을 비행. 만약 주입된 솔루션 비즈 바늘 제거 또는 이동, 실패 하는 초승달 모양의 표 피에서의 부분 취소로 곤충이이 주입 실패 했다. 10-15의 그룹에 성공적으로 삽입 된 모기 또는 3.5 온스 컵 개최를 취소 하는 5의 그룹에서 집 파리를 전송 합니다. 얇은 명주 그물 이나 그물을 커버 하 고 실내 온도에 복구. 모기와 파리 (1-2 h) 회복, 후 10% 자당 해결책으로 흠뻑 목화 공을 통해 각 지주 컵을 반전.참고: 설탕 식사10에 쉽게 액세스를 제공 하 여 생존에 자당 면 에이즈 위에 컵의 반전 단계 2.5 주입 솔루션 사이 바늘을 씻어. 완료 되 면 주입, 폐기 적절 한 sharps 용기에 바늘을 사용 합니다. 3. aedes aegypti 사망률과 산란 검정 주사 후 3 일 동안 계속 10% 자당 모기 제공 가시 죽은 모기의 수를 기록. (예: 콜라겐 소시지 케이싱) ≤12-인치 인공 막을 신선한 혈액 (즉, Aedes aegypti소)과 뜨거운 물 목욕에서 60 ° C에 열을 채우십시오. 짧게 막 종이 타월에 압 연 하 여 건조 하 고 3.5 온스 투명 컵을 들고의 얇은 명주 그물 모자에 걸쳐 누워. 을 강화 하기 위해 먹이 phagostimulant 또는 핸들 케이스 표면에 인간의 휘발성을 떠나 깨끗 한 맨 손으로 따뜻하게 혈액 소시지를가 열 후 혈액 1 m m ATP 스파이크. 혈액 공급, 후 10% 자당 지주 컵 위에 적셔 목화 공을 교체 하 고 모기 산란 컵을 전송 하기 전에 ~ 24 h 동안 휴식을 허용. 작성 하 여 건설 산란 컵 취소 ~ 30 mL 이온된 H2O와 씨앗 발 아 종이 조각을 배치 3.5 온스 검정 컵 (~ 4 c m 폭 및 5 cm 긴 능선 수직 실행) 측면 (그림 3A)에 대 한 컵의 아래쪽에 . 얇은 명주 그물 이나 그물을 커버 하 고 얇은 명주 그물 이나 그물 모자에 작은 슬릿 (~ 1 cm)를 잘라. 24 시간 후 혈액 공급에서 작은 슬릿 (~ 1 cm) 지주 컵의 얇은 명주 그물 모자에 자르고 성공적으로 먹이 개별 여성 전송-복 부에 보이는 혈액 bolus로-산란 컵 (1 여성/산란 컵)으로 부드러운 입 포부에 의해. 10% 자당 포화 목화 공 함께 산란 모자에 작은 상처를 봉인. 모기 완전히 일일 사망률을 추적 하는 동안 oviposit를 허용 하도록 5\u20127 일 ~ 27 ° C에서 컵을 개최. 해 범위에서 계란을 계산 합니다. 4. 파리 자리 부채 사망률과 산란 검정 주사 후 3 일 동안 계속 10% 자당 파리 제공 가시 죽은 파리의 수를 기록. 주입 후 3 일 짧게 모든 파리는 컵의 바닥에 움직이지 않는 때까지 들고 컵에 CO2 를 분배 하는 폴 리 에틸렌 튜브를 배치 하 여 파리를 anesthetize. 깨끗 한 케이지 stockinette 소매 취재 열기 (10 cm, 그림 3B)와 4 L 플라스틱 용기 구성에 파리를 전송. 제공 된 파리 물 입자가 굵은 자당의 혼합물 우유, 가루 및 달걀 노 른 자는 8에 건조: 4 일간 (볼륨)에 의해 8:1 비율, 기록 하 고 죽은 제거 매일 날아. 75% 밀 밀기 울 25% 수송과 가축 체중으로 사료와 혼합 하 여 신선한 비행 거리 애벌레 양육 매체에 대 한 마른 재료를 준비 합니다. (때까지 한 방울의 물 밖으로 겨우 압착 수) 62% 습기를 도달할 물을 추가 합니다. 위의 신선한 애벌레 미디어의 1:1 혼합물에서 2.5 cm 직경 공 준비와 애벌레 중간 비행 “사용” (파리는 pupated 이전 매체). 검은 무명 천으로의 광장에 공을 랩, 중간 액체, 새 어 나온 때까지 가볍게 짠 다 다음 공 주위 장소에서 옷감을 고무 밴드를 사용 합니다. 60 mL 컵에 볼을 넣고 5 h (그림 3B)에 대 한 비행 감 금 소에. 산란 공을 달걀 린스를 계란 옷감의 주름에서 제거 되도록 합니다. 계란을 나누며 피펫으로 졸업된 20 mL 원심 분리기 튜브에 그들을 전송 하 고 클러스터를 흔들어. 계란 정착 고 졸업된 튜브에 정착된 계란의 볼륨 때까지 기다립니다. 볼륨 최대 20 배 정착된 계란의 볼륨을가지고 충분 한 물을 추가 합니다. 기록 물 플러스 계란의 총 볼륨입니다. 물과 계란 정지 자기 볶음 바 또는 활발 한 교 반 혼합 하는 동안 사용 1 mL 피펫으로 팁 (팁 잘라 끝) 라인의 일련에 사전 moistened 검은 헝겊 조각에 물과 달걀 현 탁 액의 0.5 mL를 분배 하. 계산 해 현미경 계란. 단계 4.9 두 번 더 반복 합니다. 경우는 수 중 심각한 국외 자 (즉, 에 의해 다른 두 건의에서 다릅니다 > 35%), 4 수를 하 고 국외 자 무시. 샘플 당 계란의 평균 수를 계산 하 고 2는 서 스 펜 션의 계란/mL 수로이 값을 곱하면. 단계 4.8에서에서 계란의 서 스 펜 션의 볼륨에 의해 얻은 달걀/mL 값을 곱하면 됩니다. 이것은 누워 계란의 총 수에 대 한 견적 이다.