多夏巴氏杆菌自主表达采用除抑制技术

1. 媒体准备 缓冲最小介质 (bmg 与甘油, bmd 与葡萄糖作为碳源) 准备 (1 l) 高压灭菌器650毫升的蒸馏水在1升螺帽玻璃瓶中。冷却后, 加入100毫升的蒸压 10x ynb (134 gl 酵母氮基)、200毫升磷酸钾缓冲液 (1 m, ph 6)、30-100 毫升的 10% wv 或甘油 (取决于所需产生的生物量量), 从而完成培养基。在批量生产过程中), 2 毫升的无菌 500 x 生物素 (10 mg/ml) 溶液, 并在1升与无菌蒸馏水填充。注意: 所有原料必须用单独的烧瓶高压灭菌。生物素在高压灭菌时被破坏, 因此必须用0.2μm 膜过滤器进行过滤。 缓冲富媒体 (bbpg) (1 升) 1升螺旋瓶盖中的蒸馏水700毫升, 含1% 的 wv 酵母提取物和2% 的聚酮。冷却后, 加入30-100 毫升的单独蒸压 10% wv 甘油, 200 毫升磷酸钾缓冲液 (1 m, ph 值 6), 并在1升中加入无菌蒸馏水。 2. 摇瓶准备 在250毫升的令人困惑的摇瓶中加入5毫升的蒸馏水, 用两层棉布覆盖, 并用橡皮筋固定在适当的地方。用一块铝箔把布盖上。 在121°c 下对烧瓶进行高压灭菌 20分钟, 以便进行完全灭菌。 从烧瓶中取出残留的水, 并将先前准备好的介质的500毫升取出到每个烧瓶中。 3. 隔夜文化接种 在50毫升离心管中, 用所需表达株的单个新鲜菌落 (1% w/v 酵母提取物, 2% wpptone, 2% wppv 葡萄糖) 开始隔夜培养 (onc), 同时使盖子稍微开放, 以便进行适当的曝气。 让它在28°c、80% 湿度的情况下在100-130 转/分 (2.5 厘米晃动直径2.5 厘米的晃动直径) 的振动台中夜间生长。 4. 计量设置与主要文化培育 要设置在线监控系统, 请按照制造商的说明对设备进行适当校准。 放置计算机, 其中安装了相应的监视软件, 以便蓝牙连接到测量站。启动软件, 通过蓝牙连接设备。 按下前面的银色按钮, 打开生物量测量设备上的蓝牙连接。 在软件中, 单击 “设备” , 然后单击 “查找设备”。注意: 设备应显示为任务行下方窗口中的列表。如果没有, 建议检查电池是否已充电, 并且计算机是否可以连接蓝牙连接。 将找到的设备拖放到屏幕测量纸盒右侧的正方形。 单击 “连接”。注意: 连接成功时, 将显示一个控制屏幕。 要开始蓝牙连接的测试运行, 请单击 “测量”。 设置实验。 单击”开始测量”, 命名实验并启用监视所需的所有参数。注意: 每个可能的测量参数都需要许可证。 将间隔设置为3分钟。注意: 间隔决定测量点的拍摄频率, 并且每个测量点之后产生一个值。测量每分钟是非常准确的, 但大量的数据产生, 这使得它更费力地进行评估。 将平均测量点设置为11。注意: 此设置确定每3分钟实际拍摄多少个测量点。因此, 输出是11个测量点超过11秒的平均值。 输入示例的名称。 跳过下一个屏幕, 因为角度之前已经校准过 (步骤 4.1)。注意: 建议在接种主培养器之前对蓝牙连接进行测试运行, 以确保连接的计算机的稳定连接和适当位置。另外, 电池还必须充电。 在600纳米波长的分光光度计中测量在培养介质 (1:20) 中稀释的 onc (步骤 3.1) 的细胞密度。通过使用以下计算, 将50毫升的介质 (建议碳源浓度 0.3-1%, 不同的介质可能与 onc 一起接种到0.05 中的 od 600. 将烧瓶放入检测器中, 在28°c、130转/分和80% 湿度下摇晃。注意: 在开始测量之前给培养物5分钟的晃动是非常重要的, 以避免细胞粘在烧瓶底部并产生错误的值。 单击软件中的”开始测量” 。 接种4小时后, 当碳源耗尽 (步骤4.7 中描述的测定) 时, 以 0.2 ml 样品进行细胞密度测量。在培养基中适当稀释样品 (第一次测量 1: 5, 第二次测量 1:20), 并在分光光度计中测量600纳米波长的吸收。在卸下烧瓶之前, 甚至在停止振动台之前, 请始终暂停软件中的测量。注: 探测器经过校准, 以便在规定的晃动条件下记录参数, 并在记录静止培养物时屈服于无稽之谈测量。此外, 请确保始终等待5分钟的晃动, 然后再开始测量。细胞密度测量是必不可少的, 因为探测器提供的是生物量的一致值, 而不是真正的细胞密度。通过测量多个时间点分光光度法, 可以实现 od 600 值 (x 值) 与在线测量系统获得的值 (y 值) 之间的校准功能。根据以下校准函数, 这些值不是线性的, 而是对数关系中的值:y: 通过分光光度计获得的 od600值x: 通过在线测量系统获得的值k: 坡度d: 轴截距然后, 斜率和轴截距可用于将任何值转换为相应的 od600值。在 excel 中, 可以根据来自同一时间点的在线系统的值绘制分光光度法获得的 od600值。对数趋势线的加入和相应的方程将给出上述校准函数。 培养到碳源接近耗尽 (应用 12-20)。为此目的, 让培养物生长, 直到从软件图中可以看到氧气浓度接近于零, 细胞处于指数增长阶段。注: 本协议中使用的碳源浓度就是这种情况。碳源耗尽的时间点可以用在线监测系统来确定, 如 “代表性结果” 部分的图 1所示, 当氧气水平接近零时, 细胞处于指数级增长状态时相。 5. 去抑制蛋白的表达 当达到步骤4.6 中描述的时间点时, 在无菌条件下, 通过在每个烧瓶中添加四个进料盘, 开始为培养物提供食物。注: 在所述条件下, 四个甘油饲料盘释放 2 mgh 甘油根据制造商。 继续进行60-90小时的培养, 每24小时采集一次样本, 通过选择的检测方法 (例如, bradford 检测15、sds page page 16 或活性检测 ) 和细胞密度测量来监测蛋白质表达。 6. 文化收获 在 60 ~ 90小时的培养后, 用50毫升的离心管将培养物灌满, 以 4, 000 x 克、4°c 的离心离心服进行10分钟的收获。注: 上清液 (用于分泌蛋白) 或细胞 (用于细胞内蛋白表达) 可通过离心在 4, 000 x g, 4°c 下收获 10分钟, 并可进行进一步的分析。 将在线测量数据导出为电子表格文件, 从软件中进行进一步分析。 将5-10 毫升的蒸馏水灌满所有烧瓶和高压灭菌器, 使剩余的细胞失活。