التعبير المستقلة الميثانول بسطورس بيشيا تستخدم تكنولوجيات إزالة القمع
Summary
يصف هذا الأسلوب للمرة الأولى إجراءات تجريبية موثوقة لكفاءة إنتاج البروتين خالية من الميثانول المؤتلف إيندوسيبلي في بيشيا بسطورس (كوماجاتايلا فافي)، توظيف المروجين المصدر ينظم الكربون ف DCوفمدافع في تجارب صغيرة الحجم بينما زراعة يمكن رصدها المعلمات على الإنترنت، ويتم تطبيقها في تغذية والغليسيرول مستمر.
Abstract
والميثانول هو مصدر الكربون الراسخة ومحفِّز لإنتاج البروتين كفاءة توظيف بسطورس بيشيا (P. بسطورس) كمضيف على نطاق المشاريع المتناهية الصغر، ومختبر والصناعية. ومع ذلك، بسبب سميتها والقابلية للاشتعال، هناك رغبة في تجنب الميثانول مع الحفاظ على إنتاجية عالية بسطورس P.. يأتي مفاعل حيوي صغيرة الحجم (0.5-5 حجم العمل L) تستخدم عادة لتقييم سلالة وخصائصها إنتاج البروتين نظراً لزراعة microscale في لوحات عميقة جيدا يمكن التحكم بالكاد، أو تعتمد على معدات غالية الثمن. وعلاوة على ذلك، البروتوكولات التقليدية لزراعة وتحريض بسطورس P. أنشئت لتحريض التعبير أو الميثانول التأسيسية وحتى الآن، ووصفت أية بروتوكولات موثوقة للشاشة بسطورس P. التعبير سلالات مع المروجين ديريبريسيبلي في الزراعات موازية (الخاضعة للرقابة والمراقبة). لتبسيط هذه الزراعات الأولى لوصف ومقارنة سلالات جديدة من إنتاج البروتين، ونحن أنشأت نظاما زراعة قارورة هزة بسيطة الميثانول حرية التعبير التي تحاكي ظروف مفاعل حيوي بما في ذلك والغليسيرول بطء مستمر تغذية والرصد على الإنترنت، وبذلك يقترب الظروف الحقيقية في المفاعلات الحيوية مقارنة بمعظمها التطبيقية صغيرة الحجم الدفعي الزراعات. إلى محرك التعبير البروتين المؤتلف في P. بسطورس، مصدر الكربون قمع المروجين وطبقت فالعاصمة و فمدافع . أقراص البوليمر مع مصدر الكربون مضمن، الإفراج عن كمية ثابتة من الجلسرين، أكد معدل تغذية إيصال الطاقة اللازمة للإبقاء على المروجين النشطة مع الحفاظ على انخفاض توليد طاقة الكتلة الأحيائية.
Introduction
التحسن في الإنتاجية وظروف زراعة موثوق بها على نطاق واسع لإنتاج البروتين المؤتلف من الكائنات المجهرية مثل البكتيريا أو الخميرة أحد أهم الاحتياجات من التكنولوجيا الحيوية اليوم1 والنجاح التجاري للصناعة التطبيقات. داتو زراعة بسيطة الإجراءات ووسائل الإعلام، عالية الغلة وأدوات جيدة تتسم2 بيشيا بسطورس (كوماجاتايلا فافي) خميرة غير تقليدية مستخدمة على نطاق واسع لإنتاج البروتين المؤتلف. تطوير أدوات مبتكرة إضافية باستمرار لهذه الأنواع، مثل ناقلات التعبير الجديد بما في ذلك المروجين جديدة كبدائل لتستخدم على نطاق واسع فAOX1، منطقة المروج من الكحول أوكسيديز 1 الجينات3، 4،5. واعتبرت 500 bp طويلة تسلسل الحمض النووي المنبع الجينات CAT1 (CTA1) منطقة المروج، الذي يتيح لاستراتيجية جديدة لتعبير خالية من الميثانول وتنوعاً في باستوريس ص. الجين CAT1 مورثة الكاتالاز فقط من بسطورس P. والبروتين الموجود في بيروكسيسوميس. الكاتلاز دوراً هاما في إزالة السموم الأنواع الأكسجين التفاعلية، والتي تنشأ، على سبيل المثال-، من أكسدة الميثانول في مسار موت بيروكسيسومال أو أثناء أكسدة الأحماض الدهنية6،7بيتا. هو التعبير عن الجين CAT1 مكبوتة في prescence للسكر أو الجلسرين في الأجلين المتوسط وزراعة وديريبريسيد عند استنفاد هذه مصادر الكربون8. وعلاوة على ذلك، يمكن فعل التعبير عن الجين كاتالاز مع الميثانول وريماركيبلي أيضا مع حمض الأولييك، على ما يبدو أن الجينات فقط موت بسطورس P. المسار الذي يمكن أن يتسبب بحمض الأولييك حتى تصل إلى مستويات مماثلة من التعبير مع والميثانول التعريفي9.
الجزء bp 500 من هذا بسطورس P. CAT1 المروج، وهو ما يسمى فالعاصمة (في بعض الأحيان أيضا مختصر فCAT1-500)، قد تمت تجربته بالفعل لإنتاج البروتينات إينتراسيلولارلي المعلنة ويفرزها وأنه ثبت أن بديل جذاب لاثنين الكلاسيكية المروجين بسطورس ص – ف التأسيسي قويةالفجوة والميثانول إيندوسيبلي فAOX1، التي وضعت منذ أكثر من 20 عاماً. فالعاصمة كان قادراً على الوصول إلى 21% (كالب) و 35% (HRP) أنشطة الحجمي فالفجوة في السكر المتوسط غنية بالمقارنة. بناء على تحريض الميثانول، فالعاصمة لم تستجب سوى أسرع فAOX1، ولكن يمكن أن يتفوق أيضا بوضوح أنه قبل عيار 2.8 إضعاف نهائية أعلى من كالب9.
قد حددت مروج أورثولوجوس (فمدافع) إلى جانب فالعاصمة، نستعرض لمحة لائحة مماثلة. ومع ذلك، أنها أقوى بكثير مما فالعاصمة تحت ديريبريسيد وكذلك ظل المستحثة الميثانول الظروف (مخطوطة في إعداد)3.
في الحالات حيث ف التأسيسي قويةالفجوة فشلت بسبب البروتينات فسيولوجيا إشكالية أو السامة للخلايا10،11، فالعاصمة وفمدافع تمثل بديلاً مثاليا. في تجارب على المستوى الجزئي، يبدأ التعبير مدفوعا بمروجي هذه بعد نضوب مصدر الكربون الأولى (على سبيل المثال-، السكر أو الجلسرين)، مما يسهل إنتاج الكتلة الحيوية دون إثقال الخلايا مع overexpression من البروتين المؤتلف من البداية. في حين أن كلا من مروجي هذه لا تزال إيندوسيبلي من الميثانول، التنشيط بواسطة ديريبريشن يجعل استخدام إضافية تستهدف المرحلة مقارنة لتعبيرات تستخدم فAOX1- وعلاوة على ذلك، فالعاصمة وفمدافع يمكن استخدامها لإنتاج البروتين خالية من الميثانول، وهدف مرغوب فيه للعمليات الصناعية الكبيرة12.
لتطوير سلالات الإنتاج المطبقة وثوابت التعبير، قد عدة خطوات في التنمية لتمريرها من أجل تضييق من إعداد كبيرة من ترانسفورمانتس للمرشح المفضل للارتقاء. عروض تتم عادة في الإنتاجية العالية في لوحات متعددة جيدا (الحجم الصغير: أقل من 0.5 مل) من أجل اعتقال مجموعة من الحيوانات المستنسخة كبيرة بقدر الإمكان. إعادة الفرز اللاحقة وريريسكرينينج هو الخطوة التالية, متبوعاً بقارورة اهتزاز (صغيرة الحجم: 50-250 مل) أو عروض مفاعل حيوي (الصغرى)12. ومع ذلك، مرغوب فيه أن يكون أسلوب، الذي أكثر مماثلة بين جداول مختلفة من مئات ميكروليتريس في لوحات الآبار العميقة حتى مل عدة في قوارير يهز حتى الارتقاء لاحقاً بإنتاج الميثانول الحرة في التي تسيطر عليها جيدا المفاعلات الحيوية. على الرغم من أن يهز قوارير يمكن أن توفر كميات مماثلة سبق كالمفاعلات الحيوية الصغيرة، وهناك العديد من القيود، هامة للغاية لإنتاج البروتين كبير الحجم مثل التغذية المستمرة والتهوية والإنترنت رصد13 من النمو و إمدادات الأكسجين. استخدام الرصد البصري تكييف قوارير اهتزاز وتوفر أجهزة الهز بديلاً فعالاً من حيث التكلفة لمعدات أكثر تطورا لزراعة موازية مع الاستمرار في توفير المعلومات على الإنترنت المستمر حول معلمات الثقافة الرئيسية مثل الكتلة الأحيائية وتركيز الأكسجين المذاب. بطء الإفراج عن مصدر الكربون من الناقلين البوليمر يمكن تطبيقها لتأمين تغذية مستمرة والتي تسيطر عليها دون الاعتماد على الحلول التقنية المعقدة والأجهزة، ومحاكاة ظروف مماثلة أكثر من المفاعلات الحيوية من كامل بسيطة المطبقة سابقا حيث تصبح الطاقة للتعبير البروتين الجارية الحد من استنزاف الكربون مصدر9،10،.
الأسلوب التالي يصف صغيرة المتوسطة الحجم في التعبير البروتين خالية من الميثانول يمكن السيطرة عليها يستند النظام في بسطورس P. المروجين جديدة فالعاصمة وفدف. التعريفي ديريبريشن ينطوي على مرحلتين. مرحلة قصيرة أول من تراكم الكتلة الحيوية دون إنتاج البروتين الفائدة، تستخدم مصدر الكربون التي تقمع المروجين ومرحلة ثانية من إنتاج البروتين المستهدف، حيث يتم توفير مصدر الكربون في تجمعات صغيرة ولكن ثابتة الحفاظ على المروج ديريبريسيد. يتم تطبيق الرصد عبر الإنترنت من أهم زراعة المعلمات أثناء فترة زراعة كله. والهدف توفير من الميثانول الحرة، ونظام موثوق بها وقابلة زراعة بسطورس ص.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويعرض هذا الأسلوب بروتوكول موثوقة الميثانول كفاءة التعبير إيندوسيبلي المستقلة قبل بسطورس P. كبديل للتعبير البروتين الميثانول الكلاسيكية التي يسببها يقودها فAOX112. بناء المروجين دي ريبريسيبلي، مثل فالعاصمة، فمدافع أو سبق وصفها تحور فAOX1 المتغيرات17، الأساس الجزيئي لهذا المفهوم الجديد لإنتاج البروتين. أظهرت نتائج الممثل يؤكد فائدة والطابع العملي للتعبير البروتين المؤتلف في بسطورس P. المروجين مكبوتة الشطب والفرز الصغيرة مع رصد بسيطة على الإنترنت. من ناحية، يمكن القضاء على الميثانول السامة والضارة التي تستخدم عادة لاستحثاث المروج AOX1 من الزراعة. من ناحية أخرى، هي مرحلة إنتاج البروتين والنمو أونكوبليد9 على النقيض من البروتين التأسيسي التعبير، على سبيل المثال-، مع استخداماً فالفجوة. وهذا مفيد بوجه خاص عندما ينبغي أن تعبر عن الخلايا البروتينات السامة أو الضارة التي تعرض عبئا عليهم.
يتيح إمكانية البدء الزراعات بتركيزات مختلفة من الكربون مصدر قرار الكتلة الحيوية كم يود المرء أن كسب قبل مرحلة إنتاج البروتين يبدأ. عند اختيار تركيز مصدر الكربون أقل في المجموعة، يمكن تخفيض القيود نقل الأكسجين بسبب كثافة الخلية مرتفعة جداً رغم كثافة الخلية أعلى من ناحية أخرى يمكن أن يؤدي أيضا إلى أعلى بروتين التتر. نقطة الوقت الأمثل لبدء دفعة بنك الاحتياطي الفيدرالي برصد تطور الثقافة من حيث توليد طاقة الكتلة الأحيائية وتركيزات الأكسجين، يمكن أن تتقرر بسهولة كما هو مبين في الشكل 1.
للرصد على الإنترنت لمعلمات زراعة هذه، ينبغي أن تطبق نظام قياس مناسبة. الكتلة الحيوية (مثلاً، فاريو فرنك سويسري) جهاز قياس بسيطة وزعزعة نظام القياس الاقتصادي على شبكة الإنترنت لرصد الثقافة في قوارير. القارئ البصرية الإلكترونية يحدد نمو الخلايا في قارورة عبر الكشف عن الضوء المتناثرة ويقرأ إشارة من الأكسجين الاستشعار المتكاملة في قارورة. البصريات لقياس الكتلة تتكون من مصباح LED التي تنبعث إشارة خفيفة، وهي متناثرة في جزيئات (الخلايا) في المرق الثقافة واكتشاف مع الضوئي. أجهزة الاستشعار البصرية تنبعث منها الأسفار عندما متحمس مع ضوء من طول موجه معينة. اعتماداً على حجم الجزيئات أكثر الحالية، يتغير هذا إشارة الأسفار، التي يتم الكشف عنها بواسطة البصريات القارئ وترجمتها إلى قيم تركيز. ومع ذلك، قد معايرة قياس كثافة خلية تكون المنشأة مسبقاً، نظراً لنظام القياس هو قياس لا OD600 القيم الفعلية. ويمكن حساب معدل امتصاص الأكسجين من انحدار منحنى الأكسجين مع برنامج قارئ، ويتم تسجيل درجة الحرارة، فضلا عن دورة في الدقيقة بشكل مستمر جنبا إلى جنب مع معلمات أخرى. لتمكين مراقبة مع هذا النظام، أن قوارير يهز سابقا تكون مزودة بأجهزة استشعار مناسبة للمعلمات المطلوبة.
بإضافة البوليمر بطيئة–الإفراج عن أربعة أقراص توفير كمية ثابتة من الجلسرين إلى مرق الثقافة، هو تراكم الكتلة الحيوية توقفت تقريبا، واستمر إنتاج البروتين المؤتلف. تحديد النقطة الزمنية إضافة تغذية القرص ليس خطوة حاسمة في هذه التجربة، بل أنه ينبغي النظر في تثبيط بدء تغذية سابق لأوانه قبل مرحلة النمو الأسى يمكن تفعيل مروج التعبير يبدأ عند نضوب مصدر الكربون. بالإضافة إلى ذلك، قد خفضت مجموع الوقت نظراً لمحدودية القدرات البوليمر التغذية، بينما يؤخر في التغذية بعد الخلايا وقد وصلت إلى مرحلة ثابتة يمكن أن تؤدي إلى تجويع وتدهور إنتاجها بالفعل البروتين. وكان تحديد مقدار تغذية الأقراص المستخدمة في هذا البروتوكول تجريبيا للإفراج عن مصدر الكربون الأمثل للحفاظ على المروج الشطب للقمع أثناء الضغط على الكتلة الأحيائية جيل منخفضة (البيانات لا تظهر). وبهذه الطريقة، يمكن أن تكون الزراعات يؤديها بسهولة أكثر من 160-180 ح دون أي تدخل.
التطبيقات الرئيسية لهذا البروتوكول الجديد سيكون في استنساخ تعبير الفرز والتطور الإنزيم والاكتشاف، وتوصيف والهندسة من المروجين جديدة تستخدم بروتوكول زراعة خالية من الميثانول في ظروف المراقبة جيدا. من حيث المبدأ، ينبغي أن يكون البروتوكول نفسه ينطبق على استراتيجيات تغذية مختلطة يستخدم الميثانول ويغذي مصدر الكربون معفن محدودة مثل وصف بانولا-Perälä وآخرون. في18من عام 2014.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
روبكس يتلقى التمويل من مشروع “الاتحاد الأوروبي” (EU) روبكس (منحة اتفاق n ° 635734) تحت أفق 2020 برنامج البحوث والابتكار في الاتحاد الأوروبي إجراءات “أفق 2020”-ليت بيو-2014-1. وجهات النظر والآراء التي أعرب عنها هنا هي فقط تلك التي المؤلف، ولا تعكس بالضرورة آراء الوكالة بحوث الاتحاد الأوروبي. أن الاتحاد الأوروبي ليس مسؤولاً عن أي استخدام قد أدلى بالمعلومات الواردة في هذه الوثيقة.
ويشترك في تمويل أطروحة دكتوراه ج. فيشر بمنحه ل “إيندوستريناهي أطروحة” وكالة “التمويل النمساوية” فج.
ونحن نشكر جيرنوت جون (بريسنس GmbH) لإجراء مناقشات مفيدة ومدخلات قيمة لمشروع المخطوطات.
Materials
| Bacto Yeast Extract | BD Biosciences | 212720 | |
| Baffled Flask 250 mL | DWK Life Science | 212833655 | |
| BBL Phytone Peptone | BD Biosciences | 298147 | |
| BioPhotometer | Eppendorf AG | 5500-200-10 | |
| Certoclav-EL | CertoClav GmbH | 9.842 014 | |
| Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids | BD Biosciences | 291920 | |
| Feed discs glycerol | Adolf Kuhner AG | 315060 | |
| Glucose-monohydrate | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6887 | |
| Glycerol ≥98 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3783 | |
| K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6875 | |
| KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904 | |
| Multitron Standard | Infors AG | 444-4226 | |
| SFR Vario v2 | PreSens GmbH | 200001689 |
Referencias
- Bill, R. M. Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments. Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris). Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. , (2005).
- Vogl, T., Glieder, A. Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production. New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).
- Rußmayer, H., et al. Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle. BMC Biology. 13 (1), 80 (2015).
- Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii. Yeast. 14 (13), 1175-1187 (1998).
- Hartner, F. S., Glieder, A. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microbial Cell Factories. 5, 39 (2006).
- Vogl, T., et al. A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 172-186 (2016).
- Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris. Microbial Cell Factories. 11 (1), 61 (2012).
- Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
- Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena. FEMS Yeast Research. 5 (2), 179-189 (2004).
- Ukkonen, K. . Improvement of Recombinant Protein Production in Shaken Cultures. , (2014).
- Jeude, M., et al. Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique. Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in molecular biology. 1, 41-55 (1984).
- Hartner, F. S., et al. Promoter Library Designed for Fine-Tuned Gene Expression in Pichia Pastoris. Nucleic Acids Research. 36 (12), e76 (2008).
- Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).
