细胞细胞接触物蛋白质-蛋白质相互作用的荧光波动光谱测定

许多生物过程发生在细胞相互作用的部位,例如细胞粘附^{1、2、3、细胞}融合⁴和细胞识别⁵。这类事件在多细胞生物的发展和细胞细胞交流 (例如免疫反应期间) 中尤其重要。这些过程通常由蛋白质介导, 这些蛋白质被定位在表面,即在相邻细胞的质膜 (pm), 并在细胞接触时进行特定的相互作用, 这些相互作用在空间和时间上得到精确的调节。在许多情况下, 这些相互作用是直接的同型或异型蛋白质-蛋白质-蛋白质反式相互作用, 但也可能涉及离子或配体作为细胞外链接^{剂 1}。虽然具有根本的重要性, 但缺乏直接在活细胞的本地环境中探索这些特定蛋白质-蛋白质相互作用的检测方法。许多方法要么需要细胞破坏 (例如生化检测, 如共同免疫沉淀⁶)、固定 (例如,一些超分辨率光学显微镜和细胞的电子显微镜)联系^{人 7}), 或非特异性,例如,聚合/粘附检测^8,9。为了解决这一问题, 在荧光共振能量传递 (fret)¹⁰或荧光互补¹¹的基础上, 实现了荧光技术。然而, 为了在荧光体之间实现足够小的距离, 这些方法需要在蛋白质10的细胞外侧贴上荧光标签, 这可能会干扰反式相互作用。

在这里, 我们提出了一种替代荧光为基础的检测蛋白质相互作用在细胞接触。这种方法结合了荧光相关的方法 (扫描荧光相关光谱 (sfccs), 相关的数字和亮度 (ccn & amp; b)) 和混合细胞表达融合结构的蛋白质兴趣,例如,粘附受体。两个相互作用细胞中的研究受体被标记为两个光谱分离的荧光蛋白 (fp), 从细胞内侧 (见图 1a)。

所采用的方法是基于对荧光融合蛋白通过共聚焦激光扫描显微镜焦体积扩散运动引起的荧光波动的统计分析。更详细地说, 该分析探讨了在细胞细胞接触时两个相邻的 pm 中感兴趣的蛋白质的共同扩散。如果这些蛋白质经历反式相互作用, 这些反式复合物将携带荧光蛋白在两个光谱通道中发射, 从而导致两个发射体的相关荧光波动。另一方面, 如果没有结合发生, 面对 pm 的蛋白质数量波动将是独立的, 不会造成相关的波动。采集可以通过两种方式进行: 1) sfccs 基于跨细胞接触的线形扫描, 并在接触区域的位置有效地探测相互作用。通过荧光波动的时间分析, sfccs 还提供动力学信息,即蛋白质复合物的扩散系数;2) ccn & amp; b 基于对在细胞接触区域获得的一系列图像的像素化分析。它有能力探测和绘制整个接触区域 (在一个焦平面上) 的相互作用, 但不提供动力学信息。这两种方法都可以与分子亮度的分析相结合,即单个扩散蛋白质复合物在时间单位中发出的平均荧光信号, 从而提供蛋白质复合物的化学计量估计。细胞联系人。

在本文中, 我们提供了详细的协议样品制备, 仪器校准, 数据采集和分析, 以执行所提出的检测在商业共聚焦激光扫描显微镜。实验可以在任何配备光子计数或模拟探测器的仪器上进行, 也可以在高数值孔径的目标上进行。我们进一步讨论了协议的关键步骤, 并为导致人工制品事实信号波动的几个过程提供了校正方案,例如探测器噪声、光漂白或细胞运动。该检测最初是为探测粘附细胞之间的相互作用而开发的, 可针对悬浮细胞进行改性, 或适用于模型膜系统,例如巨大的单形囊泡 (guv) 或巨大的质膜囊泡 (gpmv), 从而允许定量的相互作用在不同的脂质环境或在没有一个有组织的细胞骨架^12,13。

扫描荧光相关光谱是荧光相关光谱14的一个修正版本, 是专门为探测脂膜¹⁵中的慢扩散动力学^而设计的。它是基于垂直于 pm 包含感兴趣的荧光蛋白的线扫描采集。为了探测两个不同标记的蛋白质物种的相互作用, 利用两条激光线和两个光谱分离荧光检测窗口, 在两个光谱通道中进行采集。由于 pm 中蛋白质的缓慢扩散动力学 (D≤~1 μm2/),可以通过将激发方案从一行到^15号线交替来进行无交叉对话的测量。分析从: 1) 基于 ~ 1000 线的块平均的侧向细胞运动的对齐算法校正, 2) 用最大荧光信号确定位置, 即每个块中的 pm 位置和 3) 移位所有块到一个共同的起源^12,15, 分别在每个通道。然后, 通过从所有对齐线 (即中心±2.5) 之和的高斯拟合中选择中心区域来执行与 pm 相对应的像素的自动选择。信号在每条线路中的集成产生膜荧光时间序列f ( t) 在每个通道 (g = 绿色通道, r = 红色通道)。请注意, 像素大小必须足够小,例如, & lt;200 nm, 以重建点传播函数的形状并找到其中心, 对应于 pm 的位置。在存在大量光漂白的情况下, 每个通道中的荧光时间序列可以用双指数函数建模, 然后用以下公式进行校正:¹⁶

.   (2)

需要注意的是, 与未校正的 f (t) 获得的参数估计相比, 该公式有效地纠正了从f (t)^c的相关分析中获得的振幅和扩散时间。然后, 计算荧光信号的自相关和互相关函数 (acfss/ccf):

, (2)

, (3)

其中_{f i} = f_i(t)- fi (t) 和i = g, r。

然后将二维扩散模型安装到所有相关函数 (cfs) 上:

.  (2)

在这里, n表示观察体积中荧光蛋白的数量, 每个通道的 扩散时间。该模型考虑到在所述的实验设置中, 蛋白质在 pm 中的扩散发生在 x-z 平面上, 这与通常使用的荧光相关光谱 (fcs) 实验在膜探测上的配置形成了对比扩散在共聚焦体积17的 x-y 平面上。腰 w₀和结构因子 s, 描述 z, s = w z /_{w w w w 0 中}焦距体积的伸长率 w z, 是通过光谱相似染料和相同光学设置进行的点 fcs 校准测量得到的使用扩散系数d_染料的现有值:

, (5)

其中,_染料是染料分子的测量平均扩散时间, 是通过将三维扩散模型拟合到数据中获得的, 同时考虑到所有n分子中的一小部分t向具有时间常数的三胞胎状态:

.  (5)

最后, 扩散系数 (d)、分子亮度值 () 和 sfccs 数据的相对相互关系计算如下:

, (7)

, (8)

, (9)

其中g_交叉(0) 是互相相关函数的振幅, 是 i 通道中自相关函数的振幅。

相对交叉相关的这一定义,即在公式9中使用最大值而不是平均值, 考虑到在不同浓度下存在的两个蛋白质物种的最大配合物数量受到在一个较低的数量存在的物种。

交叉相关数字和亮度基于对图像堆栈中每个像素的荧光强度的时刻分析, 这些像素是在样品中的一个固定位置获得的, 通常由大约100-200 帧组成, 具有两个光谱通道 (g = 绿色通道, r = 红色通道)。从时间均值 i i 和方差 , 计算了每个像素和光谱通道 (i = g, r)¹⁸中的分子亮度_i和数字n i:

, (10)

.(10)

需要注意的是, 给定的方程适用于真正的光子计数探测器的理想情况。对于模拟检测系统, 适用以下公式 19^、20:

, (12)

.  (13)

在这里, s 是检测到的光子和记录的数字计数之间的转换因子, 是读出噪声和偏移量是指探测器的强度偏移。一般来说, 对于任何探测器类型, 这些数量都应根据测量探测器的方差作为稳定照明的强度函数^{进行校准 19},例如, 反光金属表面或干燥的染料溶液。偏移量可以通过测量没有激发光的样品的计数率来确定.通过对检测器关联的方差与强度 (i) 图 (i) 进行线性回归, 可以确定¹⁹:

.  (14)

最后, 计算每个像素的互相关联亮度, 并将一般定义为²¹

, (15)

交叉方差在哪里。

为了过滤长寿命波动, 所有 ccn & amp; b 计算都是在箱车过滤后进行的, 每个像素²²独立执行。简单地说, n_i、 i (i = g, r) 和b_{cc 是}在滑动段中计算的,例如, 8-15 帧。这样得到的值可以进行平均, 以获得最终的像素号和亮度值。

肌细胞计量学分析
为了估计细胞接触中蛋白质配合物的化学计量, 可以分别分析 sfccs 或 ccn & amp; b 数据在每个光谱通道中的分子亮度。在 sfccs 中, 每个通道的每次测量都会获得一个亮度值。在 ccn & amp; b 中, 得到了与细胞接触相对应的所有像素的亮度直方图, 平均 (或中值) 可以作为测量的代表性亮度。通过对单体参考进行相同的分析, 可以对所有亮度值进行归一化, 直接获得检测到的蛋白质复合物的平均寡聚状态。在这一点上, 重要的是要纠正存在的非荧光 fp, 这可能会导致低估寡聚状态。这通常是通过使用单色 sfcs 或数字和亮度 (n & amp;^b ) 测量同源参考蛋白23、24的亮度来实现的。