JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

Создание и анализ кусочек опухоли эксплантах как предпосылкой для диагностики

Published: November 29, 2018
doi:
10.3791/58569
, , , , ,
1Institute for Molecular Medicine Finland (FIMM), HiLIFE,University of Helsinki

Summary

Мы предоставляем метод для генерации, выращивания и систематического анализа organotypic фрагментов, полученных от опухоли мышиных легких. Мы также описывают, как оптимизировать для толшины и как выбрать концентрации препарата для лечения опухоли фрагменты.

Abstract

Organotypic основной ткани экспланта культур, которые включают точность резки ломтиками, представляют архитектуру трехмерной (3-D) ткани, а также многоклеточных взаимодействия родной ткани. Кусочки ткани немедленно вырезать из свеже резекции опухоли сохранить пространственных аспектов неоднородности intratumor, таким образом делая их полезным суррогаты в vivo биологии. Осторожны, оптимизация условий подготовки и культивирования срез ткани имеет основополагающее значение для прогнозирования диагностический потенциал опухоли срез эксплантах. В этой связи мышиных моделях являются ценными, поскольку они обеспечивают последовательного потока материала опухоли для выполнения репликации и воспроизводимость экспериментов. Этот протокол описывает культивирования мышиных легких тканей, опухоли, полученных фрагментов с помощью блоком вращающихся инкубации, систему, позволяющую периодически воздействия тканей кислородом и питательными веществами. Наши предыдущие работы показали, что использование вращающихся инкубации единиц повышает жизнеспособность по сравнению с другими методами культуры, особенно плавающие фрагменты тканей и застойные фильтр поддерживает. Здесь, мы также показывают, что толшины влияет на жизнеспособность культивировали срезов, предполагая, что оптимизация толшины должно быть сделано для типов различных тканей. Произносится как ITH в соответствующих онкогенных функций, таких как сигнальный деятельности, стромальных клеток инфильтрата или выражение дифференциации маркеров, требует оценки фрагментов прилегающих тканей для выражения маркеров, изменено, медикаментозное лечение или культивирование, сам. Таким образом этот протокол описывает поколения мышиных легкого опухолевые фрагментов и их культура на блоком вращающихся инкубации и демонстрирует, как ломтики следует систематически анализировать для выражения маркеров разнородных тканей, как предварительное условие до исследования ответ наркотиков.

Introduction

Тканей твердых опухолей, включая рак легких, экспонат генетических и фенотипической неоднородности и гавани комплекс микросреды1,2. Взаимодействие между опухолевых клеток и их окружающие влияния микроокружения на наркотиков чувствительность и сопротивления механизмы3. Это подчеркивает необходимость для доклинических моделей, которые можно точно модель биологической сложности и функции, действуя в родной опухоли. Точность cut ломтики непосредственно производным от свежих опухоли обеспечивают уникальный ресурс, как они имеют основные возможности представлять в vivo биологии, по крайней мере на короткий промежуток времени, в том числе фенотипов пространственно распределенных в отдельных опухоли. Резекции клинических опухоли являются одной из немногих персонализированные образцов, которые могут быть получены от больного раком, и их диагностики использования заслуживает изучения.

Истории organotypic культуры восходит кначале 19 века, когда человека внутричерепной опухоли были руки разрезать на куски ткани и культивировали, используя так называемый висит метод drop. Фрагменты тканей были прикреплены к coverslip и возможность окунуться в гепаринизированным человеческой плазмы, после чего coverslips были инвертированы, опечатаны и культивировали несколько недель4. Вручную вырезать опухоль штук с были культивируемых с помощью целого ряда других методов, таких как плазмы сгустки5, в жидких средах6, или на 0,45 мкм поры размер фильтры6. Термин «organotypic» был впервые использован в 1954 году, в исследование сетчатки дифференциация куриных эмбрионов глаз7. Это последовало исследования, используемые эксплантов ткани легких и сердца, производный от куриных эмбрионов8и мозг эксплантов от взрослых крыс9.

Различные нарезки методы были описаны, а именно ручной чопперы10,11, Krumdieck ткани среза12,13и vibratomes11,14,15, 16. Срез ткани Krumdieck генерирует сердечников цилиндрических ткани, которые затем нарезанный ломтиками круговая ткани, используя микротом. Vibratome, с другой стороны, использует вибрирующий микротом лезвия. В исследовании на кусочках печени было показано, что Leica vibratome генерирует более воспроизводимые и последовательной ломтиками, по сравнению с Тесак Krumdieck15. Были использованы толщины срез, начиная от 250 до 500 мкм, и исследования доклад поддержания жизнеспособности и морфологические особенности даже до 16 дней14,10,17,18. Однако опухоли имеют переменную метаболические профили, которые могут повлиять на потребности в питательных веществах, и такие параметры, как жесткость и матрица состав ткани могут влиять на поток питательных веществ и аэрации. Поэтому вполне вероятно, что каждый тип ткани требует оптимизации условий нарезки и культуры.

Различные культивирования методы были использованы для поддержки ломтик культур: я) стационарные межфазной культуры, также называется застойной поддержки культуры, в которой фрагментов помещаются поверх полу пористые мембраны Вставка, погруженный в среде культуры. В этом в верхней части ломтики подвергается воздействию воздуха, в то время как внизу дополняется питательные вещества через пористые вставки14,19; II) шпатель метод, первоначально разработанные для культуры целые органы или фрагментов эмбриональной ткани. В этом фрагментов помещаются поверх листа хлопка или фильтр, поддерживаемых металлической сеткой, и фильтр замачивают в культурной среде. Чтобы сохранить влажной ткани, тонкий слой среднего добавляется поверх фрагментов20,21,22. Эти первые два являются так называемые воздуха жидкость межфазной культур; III) ролик трубки культур, в которых фрагменты помещены внутри плоской стороне пластиковой трубки, содержащих среднего, и медленно труба вращения гарантирует, что ткань покрыта средне во время первой части цикла, или пористый во второй23; IV) вращающейся инкубации единицы, в которых фрагменты периодически подвергаются воздействию среды питательными веществами и аэрации. Отличается от прямошовных труб, в этом методе, фрагменты помещены на вершине пористых титановых сеток в 6-ну пластины с питательной среды24.

Фрагменты тканей производным от резекции солидных опухолей логически настоящей привлекательным ex vivo модель, в которой для проверки реакции лечение анти-рак агентов, как они разрешают оценки жизнеспособности, целевой путь активность и молекулярных профили конкретной опухоли в присутствии его родной опухоли микроокружения. Однако оценить ли ответы наркотиков, измеряется в опухоли фрагменты прогнозирования в situ ответов, важно оценить, какие фрагменты тканей степени сохранить опухоль – специфичные биологических функций, таких как пролиферации клеток, Гистопатология конкретных клеток или онкогенные сигнальные деятельности. Влияние механического стресса, вызвало во время подготовки срез, ломтик обработки или культуры индуцированной приспособления как качества, так и биологических функций кусочков ткани являются фундаментальные вопросы, тесно связаны с способность осуществлять опухоли производные фрагменты для функциональной диагностики.

Наш IMI-финансируемые консорциум проекта PREDECT (http://www.predect.eu) излагаются систематически адрес эти фундаментальные вопросы, изучая эксплантов фрагментов из различных источников. Использование фрагментов, полученных от модели рака груди, простаты и легких, эти совместные усилия используются качественные read-outs, а также количественные гематоксилином и эозином (H & E) – на основе показаний продемонстрировать требование для атмосферного кислорода и застойные фильтр опоры для поддержания жизнеспособности культивированный срезов до 72 ч. Кроме того, иммуногистохимия (IHC) анализы на искусственный ломтики показали интра фрагментные жизнеспособность градиенты, свидетельствует в градиенты некроза в фрагментов, полученных из мышиных немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), эстрогеновый рецептор (Эр), HIF1α и γH2AX градиенты в ломтики рака груди, или андрогенных рецепторов (АР) выражение градиенты в рак простаты фрагменты25. Интересно, что внутри ломтик жизнеспособности градиенты в 24 h культур мышиных НМРЛ были спасены культивирования в блоком вращающихся инкубации, и наши недавние исследования показали, что жизнеспособность был продлен до 72 ч26. Особенности верхней стороне остается наиболее жизнеспособным26, одобрив, что ответ анализа наркотиков на ломтики лучше всего осуществляется на этой стороне ткани.

Хотя он по-прежнему остается вопрос о том, как далеко кусочки ткани можно резюмировать в situ функции опухоли, они широко используются для проверки ответов на анти-рак агентов, включая целевые наркотики, моноклональных антител и химиотерапевтических агентов 10,11,13,14,18,27. Мы недавно показал, что мышиных НМРЛ ломтики Показать динамические изменения в распространение и онкогенных сигнальной деятельности после выращивания по сравнению с свежесрезанных 0 h ломтиками26. Это означает, что важно расследовать ли целевой в situ биологические функции надлежащим образом сохраняются во время выращивания, до исследования возмущений. Несмотря на эти выводы, мы показали, что опухоли фрагменты можно моделировать пространственное ответ целевой терапии, среди наркотиков, лечения остаются краткое (24 ч) и начато в самом начале культивирования26. Следующий протокол описывает важные проверки аспектам, касающимся создания и анализа культур кусочек опухоли, до их применения в фармакологических Наркологическая экспертиза.

Protocol

Все мыши эксперименты, описанные в данном исследовании были выполнены, следуя указаниям из финской национальной Комиссия животных экспериментов и были утверждены Комитетом экспериментальных животных в Хельсинкском университете и провинциальных государственных Управление Южной Финляндии (лицензия номер ESAVI/9752/04.10.07/2015). 1. подготовка до нарезки Держать наготове следующие материалы: vibratome держатель образца, vibratome буфера лоток, 10 см культуры пластины, 24-ну пластина, 10 мл пипетки, пипетки мальчика, отходов мешок, 70% EtOH в 50 мл трубки для дезинфекции инструментов и ткань клей. Подготовка vibratome: протрите держатель лезвия с 70% EtOH, прикрепить новое лезвие и выполнять vibrocheck согласно инструкциям, приведенным в руководстве (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf).Примечание: Важно для выполнения vibrocheck шаг, как она минимизирует вертикальное отклонение лезвия и обеспечивает хорошее качество ломтиками. Заполните каждый хорошо из 24-ну пластины с 1 мл раствора из Хэнкс сбалансированный соли раствора (HBSS) дополняется 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл (HBSS + P/S); Держите пластины на льду. Подготовка питательной среды F12 дополняется 100 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина, glutamax 2 мм, 22 мм глюкозы и 10% плода бычьим сывороточным (ФБС).Примечание: Опухоль срез питательной среды и фактор роста добавки могут варьироваться в зависимости от ткани опухоли25. Подготовьте необходимое количество средних F12 для лечения наркомании, используя тот же состав, как описано в шаге 1.4, но пропуск FBS.Примечание: Поскольку факторы роста в сыворотке может повлиять на онкогенных сигнализации в культивированный ломтиками, сыворотки свободной среды рекомендуется для краткосрочных исследований наркотиков возмущений на срезах опухоли. Если проанализировать долгосрочные ломтик культур, важно сначала оценить эффект сыворотки свободной среды на жизнеспособность тканей и опухоль – специфичные маркер выражения в необработанной ломтик культур. 2. сбор опухоли подшипник легких Усыпить опухоль подшипник мыши на шейки матки дислокации, когда она показывает симптомы затрудненное дыхание и потеря массы тела.Примечание: CO2-опосредованной эвтаназии, как известно, вызывают гипоксические условия в легких, которые могут иметь влияние на жизнеспособность фрагмента или онкогенных деятельности через выявление гипоксических ответ. Растянуть Усыпленных мыши на пенопласт крышку, вставив 30 G иглы в все четыре лапы, таким образом, чтобы грудь подвергается. Разрезать кожу от живота к груди и вплоть до области шеи. Разрезать грудную клетку, а затем диафрагма подвергать легких и сердца. Храните ножницы в угловой положении, чтобы избежать повреждения тканей. Вскрыть опухоль подшипник легких вместе с сердца и поместите их в Тюбик 50 мл, содержащие 30 мл ледяной HBSS + P/S; Держите трубку ледяной и как можно быстрее приступить к следующему шагу.Примечание: Задержки в обработке опухолей легких может изменить онкогенных функций, например сигнальный путь деятельности. 3. поколения опухоли легких точности резки ломтиками Перенесите опухоль подшипник легких в HBSS + P/S в 10 см пластины культуры ткани, хранятся внутри ламинарных капюшоном. Отдельные долей легких, используя стерильные ножницы, щипцы и выберите лопастями с опухоли на поверхности для нарезки.Примечание: Опухоли > 3 мм размер пригодных для нарезки. С нормальной легочной ткани вокруг большой опухоли компромиссов, нарезки из-за различий в жесткость ткани опухолевой ткани проходят нарезки должна быть отделена от нормальной ткани, таким образом, что очищенный опухоли регион сталкивается с vibratome лезвие. Создавать плоские ткани обработанной поверхности режущей частью нормальной легочной ткани, которая окружает опухоли с стерильным скальпель и окунуть плоский слайд в капле Цианакрилатный клей. Подключите эту сторону на держатель образца vibratome, что опухоль сталкивается лезвие в вертикальном положении. Пусть клей сухой для 2-3 мин.Примечание: Нормальной легочной ткани, приклеены к держатель образца не вмешиваться с нарезки ткани опухоли, и нарезки остановлена до нормальной ткани. Опухолевой ткани иногда поворотах за счет спонгиозной текстурой нормальной легочной ткани, приклеены к держатель образца, ставя под угрозу его вертикальном положении. Если это произойдет, клей кусок поддержки дополнительных нормальной легочной ткани рядом с предварительно смонтированные нормальной легочной ткани сохранить опухоли в вертикальном положении (Рисунок 1A iii). Поместите держатель образца в лоток металлический буфер и заполнить его с холодной HBSS + P/S до тех пор, пока ткань погружается в буфере. Поместите лоток металлический буфер на белой ледяной ванне и добавить лед, так чтобы сохранить прохладу ткани во время нарезки. Подключите белый ледяной бане к vibratome. Выберите подходящие параметры среза: амплитуда, от 2.5-2.8, нарезка скорость между 0.10-0,14 ms и толщина резки диапазоне 160-250 мкм.Примечание: Нарезки параметры должны корректироваться с учетом жесткость ткани. Небольшиой легче срез, чем мягкие ткани, и мягкие ткани требует нарезки с низкой скоростью (0,1 – 0.12 мс) и выше амплитуды (2,6-2,8). 4 – 5 мм большой опухоли обычно обеспечивает 15 – 20 ломтиками толщиной в 200 микрон. Для краткосрочных выращивания мышиных опухоли могут нарезанный полу стерильных условиях за пределами ламинарных капюшоном. Однако клинических опухоли всегда быть нарезанный внутри класса II биобезопасности ламинарных капюшоном чтобы избежать воздействия возможных инфекционных агентов в тканях человека. С помощью стерильный пинцет, соберите кусочки в 1 мл HBSS в отдельных скважинах 24-ну плиты провел на льду, тесно следить за порядок, в котором нарезанный ломтиками. Марк каждый хорошо из 24-ну пластины согласно экспериментальный план. Например Марк последовательных Уэллс 24-ну плиты как культура моменты времени или 0 h, управления транспортным средством (C), препарат лечение (T) (рис. 1B ii).Примечание: Не беспокоить или тянуть опухолевой ткани собирая кусочком, как это изменит ориентацию опухоли отношении угол лезвия, приводит к несогласованности в толщинах последующие фрагменты. Когда все фрагменты собраны, перенести их на Титан сетки (2-3 ломтика на сетке) помещены в 6-ну пластины, содержащие 2,5 мл питательной среды на хорошо. Убедитесь, что нет пузырьков воздуха образуются между Титан сетки и среды. Чтобы загрузить фрагмент на сетке, держите пластину 6-Ну в положении под углом так, что часть среды охватывает сетки и место среза в средне-и на сетке; Используйте щипцы для распространения на срез, если он локонов. Загрузка 6-ну пластины на вращающейся инкубационный блок внутри увлажненные инкубатор, поддерживается при 37 ° C с воздуха 95% и 5% CO2и начать цикл вращения (рис. 1 c i-ii).Примечание: Металлических сеток и 6-ну плиты должны быть точно вес сбалансированный перед включением блоком вращающихся. Важно расположить ломтики в середине сетки таким образом, чтобы они полностью поочередно воздушных и жидких фаз во время циклов вращения. Фрагменты, которые являются слишком низкими или высокими не подвергаются надлежащим образом кислорода и питательных веществ, (Рисунок 1 c я), которые могут поставить под угрозу жизнеспособность тканей. Важно следовать положение фрагмента на сетке во время выращивания, как срез можно иногда сползают вниз. Если это происходит в течение 1 – 2 ч наступления культуры, исправить свою позицию и запишите, что этот пример может быть поврежден. Фрагменты, которые mispositioned для длительного периода времени должен быть уничтожен, как жизнеспособность тканей значительно пострадавших от ненадлежащего оксигенации и снабжения питательными веществами. Собирают кусочком ткани, прилегающих к искусственный ломтики как 0 h, uncultured, ссылки. Соберите по меньшей мере три ссылки срезы представлять верхней, средней и центр кусочки ткани. Исправить 0 h срезов немедленно и процесс, как описано в разделе 5.1.Примечание: Если количество фрагментов ограничено, например, если сделали несколько сложных процедур или технических реплицирует, сравнение каждого обработанного образца с его соседних образца 0 h может быть трудно. В таких случаях используйте ближайший ломтик 0 h (по крайней мере 400 – 600 мкм друг от друга) для оценки относительной ткани жизнеспособности или выражение соответствующих маркеров в культуре начала. Для долгосрочной выращивания пополните питательной среды каждый день. Поднимите сетку, содержащую срезов ткани, используя стерильный пинцет и поместите его в пустой колодец 6-ну плиты; 70% среды замените свежей питательной среды и место сетки обратно в среде. Продолжения цикла вращения, как описано в шаге 3.6. 4. лечение опухоли фрагменты с малых молекул ингибиторов Подготовьте необходимые концентрации соединений в среде обращения. Как правило для достижения цели ингибирование в срезах ткани требуется 10 раз выше концентрации препарата по сравнению с IC50s, измеряемая в клеточных культурах. Чтобы избежать неспецифических цитотоксичность, проверьте диапазон концентраций для получения минимально эффективной концентрации для каждого соединения. Здесь, мы протестировали 0,1 – 1 мкм PI3K/mTOR ингибитор dactolisib и 0,05 – 0,5 мкм selumetinib ингибитор MEK мышиных НМРЛ срезов. Добавьте 2.5 мл СМИ с разбавленным наркотиков или ДМСО или другой элемент управления транспортного средства в пластину 6-хорошо. Уложите Титан сетки скважин. Место ломтики ткани на сетках, как описано в шаге 3.6. Выполнение автомобиль или наркотиков лечения для 24 h. продолжить с ткани фиксации и обработки ломтики в парафиновые блоки, как описано в разделе 5.Примечание: Продолжительность лечения наркомании могут быть оптимизированы в зависимости от цели эксперимента, принимая во внимание фрагменты тканей способность удерживать на месте функции ткани проанализированы в период культуры. 5. Фиксация и обработка срезов ткани Аккуратно поднимите uncultured 0 h ссылка или культурный срез на фильтровальную бумагу, смоченную в PBS. Чтобы сделать это, добавить 2-3 мл PBS в 10 см пластины, пусть кусок плавать в PBS и «рыбы» он подняв срез на фильтровальной бумаге с парой щипцов. Перевести фильтровальной бумаги в histocassette и добавить капля разбавленного гематоксилином (1:1 в деионизированной воде) поверх ткани фрагмент заметно Отмаркируйте положение фрагмента во время последующей обработки шагов (рис. 1 d). Закройте кассету и перевести его на 4% раствор нейтрального формалина буферизации. Исправить тканей на ночь при 4 ° C.Примечание: При размещении фрагмент над фильтровальной бумаги, убедитесь, что в верхней части сегмента вверх; Это необходимо следовать сверху, средний и нижней части фрагмента при резании и анализа как описано в пункте 6.3. Следующий день, перевести кассеты на 70% EtOH и немедленно приступить к шаг обработки ткани парафин встраивание. До обработки ткани, стирать histocasettes в 100% EtOH 2 x 10 мин. В этом случае использование микроволновой станции для обработки тканей. Выберите программу для ткани толщиной 1 мм и следуйте инструкциям, приведенным в руководстве (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).Примечание: При использовании других тканей, Станки для обработки, использования программа подходит для тонких тканей образцов. Для парафин встраивание, откройте histocassette и использовать скальпель аккуратно фрагмент из фильтровальной бумаги. Отменить фильтр бумага и перевести фрагмент в формы, содержащие жидкий парафин. Пресс ткани против нижней части встраивание формы, например с плоской весом, чтобы обеспечить даже секционирование. Место в нижней части histocasette на вершине плесень, пусть прохладно плесень на холодной паштет на 30 мин и отделить плесень от блока парафина.Примечание: Как альтернатива горизонтальных встраивание, это позволяет вставлять фрагмент опухоли вертикально, позиционирование slice в вертикальном положении. Вертикальных разрезов легко разрешить анализ градиентов в жизнеспособности или функциональных маркер выражения одного раздела 25. Градиент анализ ломтиками горизонтально встроенный требует парафин, секционирование, как описано в пункте 6.2. 6. обработка и анализ формалин исправлена и парафин врезанных (FFPE) тканей Подготовка 4 мкм шлифов блоков срез ткани FFPE, используя микротом. При резании, отрегулируйте угол блока, так что поверхность блока горизонтально ориентированной отношении лезвия; Это необходимо для получения даже участки по всей ткани. Чтобы включить захват потенциальный градиент культуры индуцированной жизнеспособности, миграции клеток через ломтиками или градиентов в выражении биомаркер через искусственный ломтиками, собирать секции от верхней, центром и нижней слоев каждого из кусочек ткани на объект слайды как объяснено ниже. Соберите последовательные ткани разделов ломтик парафин врезанных тканей сначала на верхней части стеклянных скольжениях. Продолжить сбор в разделах более глубоких слоев ткани в середине следуют нижней части стекла слайды (Рисунок 1E).Примечание: Для размещения трех секций на слайде стекла, от подрезать излишек парафина, окружающих фрагментов встроенных ткани. Разрешить секций для высыхания на ночь при 37 ° C и перейти с H & E пятнать или иммуногистохимии, как описано ниже.Примечание: Может произойти потеря антигенностью, когда FFPE секции хранятся при высоких температурах или для длительных периодов времени. Парафиновых срезах, рекомендуется хранить при 4 ° C, и IHC анализы должны осуществляться в течение 6 месяцев после разрезания. Для H & E пятнать, deparaffinize и увлажняет парафиновых срезах следующим: Ксилол 3 x 5 мин, 100% EtOH 3 x 1 мин, 96% EtOH 2 x за 1 мин., 70% EtOH 1 x 1 мин и деионизированной воды 2 x 1 мин. Инкубировать в подразделах свежего отфильтрованного гематоксилином решение для 10 мин и промыть под проточной водой для 5 минут окунуться в разделах кислоты спиртовой (1% HCl в 70% EtOH) 2 раза, и мыть под проточной водой на 5 мин, после инкубации с 0,5% эозина для 2 м в. После шаг эозином, обезвоживает разделы, погружая слайды в решениях алкоголя и ксилола, следующим: 96% EtOH 2 x 15 s, 100% EtOH 3 x 30 s, ксилол 3 x 1 мин. Наконец внедрите разделов в среде на основе ксилол монтажа. 7. анализ жизнеспособности тканей и биомаркерное выражения Приобрести изображений с высоким разрешением, создавая сканирует весь слайд из H & E-окрашенных слайды с помощью сканера. Чтобы оценить жизнеспособность тканей, делать снимки из ткани сканирования, представляющих верхней, средней и нижней секции ломтики. Вручную с помощью программного обеспечения Фото Манипулятор, рисуйте маски на области некротических тканей, следуют количественная оценка некротические регионов с использованием MATLAB. Вычислите относительную жизнеспособность ломтиками, возделываемых в разное время точек по сравнению с ближайшего среза 0 h, как это сделано в наших предыдущих исследования (Närhi et al., Рисунок S2B и C)26. Аналогичным образом оценить потенциальные интра ломтик жизнеспособность градиентов путем количественной оценки жизнеспособности в верхней, средней и нижней части культурный срез и вычислить относительную жизнеспособность каждой секции его ближайший фрагмент 0 h.Примечание: в то время как простое выращивания мышиных НМРЛ ломтики индуцирует некротической смерти клетки, биологической реакции ex vivo условий культуры зависимости опухолевой ткани. Например градиенты в HIF1α и ER, макрофаги, отмечен F4/80 были обнаружены в культурах поддерживается фильтр среза, производный от рака молочной железы модель25. Таким образом H & E – а также на основе IHC анализы культивировали ломтиков должны рассматриваться для каждого типа ткани. Выполните IHC на парафиновых срезах. Следующий протокол IHC является отправной точкой и требует дальнейшей оптимизации для других антител. Кратко, deparaffinize и увлажняет парафиновых срезах следующим: Ксилол 3 x 5 мин, 100% EtOH 3 x 1 мин, 96% EtOH 2 x за 1 мин., 70% EtoH 1 x 1 мин и деионизированной воды 2 x 1 мин. Чтобы разоблачить антигенных эпитопам, выполнять тепло опосредованной антигена извлечения с помощью лимонной кислоты 10 мм при pH 6 в модуле PT, следуют блокирование с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 10% нормальной козьего сыворотки (НГС) в однократном ПБС 30 мин при температуре (21-23 ° C). Инкубировать основное антитело, разводят в 5% и 1% BSA NGS в однократном ПБС, либо для 1-2 ч при комнатной температуре. Проинкубируйте с вторичного антитела анти кролика, за 30 мин при комнатной температуре, после обнаружения с помощью 3, 3 ‘ диаминобензидин (DAB). Секции являются counterstained с гематоксилином (разбавленный до 1:10 в деионизированной воде) для 30 s и мыть под проточной воде в течение 5 мин, следуют обезвоживания, погружая слайды в решениях алкоголя и ксилола, следующим образом: 70% EtOH 1 x, 96% EtOH 2 x, 100% EtOH 3 x, ксилол 3 x ( Шаг 1 мин). Наконец внедрите разделов в среде на основе ксилол монтажа. Приобрести весь слайд Сканирование слайдов, ИГХ витражи, экспортировать их в виде изображения TIFF на увеличение соотношения 1:4 с помощью просмотра изображений и выполняют с помощью ImageJ количественной.Примечание: как альтернатива к сканеру, микроскопических изображений на 20 X 40 X увеличение или могут быть приобретены для количественной. Увеличение изображения могут быть выбраны в зависимости от маркера для количественной оценке; высокое увеличение изображения рекомендуются для ядерной окрашивание, хотя цитоплазмы или мембраны маркеры могут быть количественно с помощью 20 X изображения. В этом случае для количественного определения ядерного маркеров, NKX2-1 выражение, преобразовать каждое изображение в 16-битные изображения с помощью Фиджи-ImageJ и загружать изображения для анализа изображений. Настройка конвейера анализа изображения в зависимости от анализа. В этом протоколе, используйте следующий конвейер для количественной оценки положительных ядер NKX2-1: идентифицировать первичные объекты | Измерения интенсивности объект | Фильтрация объектов (минимальное значение = 0,0025) | Вычислить мат Результаты представлены в виде процентных долей DAB-окрашенных ядер из общего числа ядер.

Representative Results

Рисунок 1 представляет рабочий процесс для поколения, выращивания и анализа точности надреза ткани фрагментов, полученных из мышиных НМРЛ опухоли. Для этой демонстрации мы использовали опухоли из генетически мыши модели (ГЭММ), укрывательство условного активации KrasG12D вместе с потерей Lkb1 (также известный как Серин/треонин киназу 11), называемой ФОК Мышь селекции и легких опухоль начала была выполнена, как описано в26,28. Рисунок 2A демонстрирует влияние толщины срез ткани на жизнеспособность культивировали в течение 24 ч с использованием блоком вращающихся инкубации срезов. Результаты показывают, что 160 мкм тонкими ломтиками содержат большие некротические участки через фрагмент. Кроме того 250 мкм тонкими ломтиками показывают некроза градиента через срез, по сравнению с 200 мкм тонкими ломтиками. Вполне вероятно, что бедные общей жизнеспособности тонкий 160 мкм вызванных технической обработки во время позиционирования кусочки поверх сетки, как эти хрупкие и имеют тенденцию к скручиванию. С другой стороны когда фрагменты слишком густой, они могут стать подверженным недостатки в кислорода и питательных веществ диффузии через срезы, который в мышиных НМРЛ эксплантах свидетельствует как некротическая смерть градиента25. Следует, однако, отметить, что фрагменты с переменной толщины могут быть сгенерированы из одной опухоли, несмотря на использование одинаковых vibratome параметров. Поэтому рекомендуется проанализировать несколько реплицирует из образцов различных опухоли. Важно каждый тип ткани требует оптимизации толщины срез для достижения максимальной жизнеспособности, как текстура ткани и твердость может повлиять на оксигенации и поток питательных веществ. Рисунок 2B -2c иллюстрирует количественный анализ IHC выражения NKX2-1, маркер высокодифференцированных легких аденокарциномы (AC) в образцах культивируемых до 72 ч и соответствует 0 h ломтиками. Результаты показывают, что NKX2-1 выражение существенно не изменяется в культивированный ломтика по сравнению с 0 h uncultured ломтиками, предполагая, что процесс выращивания открыто не затрагивает статус дифференциация переменного тока опухолевой ткани. 2D рисунок демонстрирует полезность кусочки ткани опухоли для оценки эффективности целевых препаратов. Недавно мы показали что крас мутант мышиных ACs экспонат высокое выражение фосфорилированных ERK1/2 (маркировка повышенная активность MAPK путь) по сравнению с железисто (ASC) опухоли, а выражение фосфорилированных 4EBP1 (маркировка mTOR активность ) аналогичным образом выражается в переменного тока и ASC опухоли. Для проверки, если эти пути могут быть эффективно нацелены на кусочки ткани, кусочки ткани KL AC лечили ДМСО или титруют количество соединений, а именно: 0,1 – 1 мкм dactolisib целевой путь mTOR или 0,05 – 0,5 мкм selumetinib целевой MAPK путь. Результаты показывают, что 1 мкм dactolisib или 0,5 мкм selumetinib эффективны в подавлении фосфорилирование 4EBP1 или ERK1/2, соответственно. Кроме того дозозависимый ингибирование целевых фосфолипопротеиновый указывает, что фрагменты тканей также могут быть использованы для проверки фосфорилирования специфические антитела. Рисунок 1: Схематическое представление рабочего процесса для создания и анализа мышиных НМРЛ опухоли производные ломтик эксплантов. (A) схема описания сбора и подготовки опухоли подшипник легких для нарезки. Долях легких собирают от мыши и опухолевой ткани рассекается от нормальной ткани. Черные стрелки и звездочки указывают на примерно 4 мм и 1 мм опухоли, соответственно. Белая стрелка указывает легочной ткани на приклеены к поверхности держателя образца. Красная стрелка указывает на дополнительную часть нормальной легочной ткани поддержки сохранить опухоли в вертикальном положении. (B) Vibratome нарезки и сбор кусочков ткани. Белая стрелка указывает направление нарезки. Совокупность последовательных фрагментов в 24-ну плиту содержащие холодной HBSS + P/S. Ломтики может быть культивировали для различных временных точек (здесь, 24-72 ч), чтобы оценить выражение опухоль – специфичные маркер во время выращивания (верхняя строка), или может использоваться для выполнения медикаментозного лечения. C: транспортного средства контроля, T: медикаментозное лечение. (C) размещение кусочек ткани для выращивания с использованием вращающихся инкубации единиц. Наклона пластины 6-Ну так, что некоторые среды охватывает в верхней части сетки, Поместите кусочек ткани в середине сетки поверх среды и распространение фрагмента, используя пинцет. Обеспечить 6-ну пластины вес, баланс для плавного вращения цикла. X: указывает неправильный, и : указывает правильное позиционирование фрагмента. (D) фотография блока FFPE кусочек опухоли. Черная стрелка указывает на фрагмент парафин врезанных тканей, окрашивали гематоксилином. (E) схемы, показаны порядок секущей ломтики в FFPE блоков; Эти разделы могут быть обработаны для оценки жизнеспособности тканей и опухоль – специфичные биомаркер выражение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: оценка жизнеспособности и histotype специфических маркеров выражение и целевых медикаментозное лечение на кусочках ткани НМРЛ. (A) представитель H & E изображения переменного тока NSCLC ломтики указанной толщины, культивированный за 24 ч. 200 мкм тонкими ломтиками поддерживать лучше жизнеспособность по сравнению с 160 мкм и 250 мкм тонкими ломтиками. Темно-синий представляет жизнеспособных ткани запятнанных H & E и розовый показывает pseudocolored некротических регионов. Светло-голубой указывает регионы, исключены из анализа, либо из-за плохой ткани качества или наличием фиброзной стромы. T1 и T2 являются биологические реплицирует производным от двух различных опухолей. Шкалы бар = 500 мкм. (B) представитель IHC изображения NKX2-1 выражение в AC ломтиками, культивированный для указанного времени точек. Стрелка указывает области показано увеличение. Результаты показывают, что NKX2-1 выражение не изменено культивировали ломтиками, по сравнению с 0 h ломтиками. Шкалы бар = 500 мкм и 50 мкм для низких и высоких увеличениях, соответственно. (C) количественной оценке данные, показанные в пункте (B). (D) представитель IHC фото фосфорилированных 4EBP1 или pERK1/2 выражение в 0 ч ломтики, ломтики относились с ДМСО или титруют количество dactolisib (dact, верхний ряд) или фосфорилированных выражение pERK1/2 в 0 ч фрагмента или фрагментов, относились с ДМСО или selumetinib (sel, нижней строке). Черные квадратные коробки указывают области показано увеличение. Шкалы бар = 1 мм или 50 мкм для низких или высоких увеличение, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Различные комплекс в vitro опухоли, включая 3D культур и organoids, были разработаны модели для пилки архитектуры и онкогенных функции в vivo опухоль ткани29,30. Тем не менее создание 3D культур или organoids включает в себя ткани диссоциации и селективный рост типа одной ячейки или совместного культуры выбрать несколько типов клеток в искусственной среде. Как следствие такие модели неполно захватить тонкости опухоли неоднородность и опухоли стромы взаимодействий. Organotypic опухоли фрагменты, с другой стороны, сохранить ткани архитектуры и биологического сложностей в situ опухоли, без большой манипуляции. Эта способность тканей срезы для модели опухолевых клеток в их родной микроокружения делает их особенно привлекательными для доклинических исследований. Мы сообщалось ранее Оптимизированный рабочий процесс для создания и анализа точности надреза опухоли фрагментов, и показал, что, по сравнению с фильтр поддерживает, блоком вращающихся инкубации улучшить жизнеспособность краткосрочных мышиных НМРЛ ломтик культур25 , 31. Однако, выращивание на вращающихся единиц является технически сложным и требует постоянного контроля. Мы здесь представляем протокол для поколения срез ткани опухоли и практическое использование вращающихся инкубационный блок к их культуре, а также сопровождающих методы мониторинга ломтики возможность захвата в situ опухоли биологии, предпосылкой до наркотиков Ответ тестирования.

Несколько важных шагов в протоколе обеспечения целостности тканей и жизнеспособности опухоли фрагменты. Если нормальной легочной ткани окружает опухоли, vibratome может генерировать фрагменты с несовместимым толщиной или повредить ломтики, из-за различия в текстуре и жесткость нормальных и опухолевых тканей. Таким образом важно удалить окружающие нормальной легочной ткани до нарезки опухоли. Другим важным шагом является Толщина нарезки, которая должны быть тщательно оптимизированы для каждого типа ткани. Кроме того после нарезанный, важно, что срез размещается примерно в середине сетки, поэтому для обеспечения точной прерывистый погружения в питательной среды и воздействия кислорода. Наконец важно следовать позиции ломтиком период его вращения, как кусочек может опускаться среду; Если это произойдет, дальнейшие действия могут быть приняты как описано в шаге 3.6 протокола.

В дополнение к обработке для обеспечения целостности тканей есть также важные шаги в анализе IHC интерпретировать как фрагмент напоминает родной ткани. Наши предыдущие исследования показали, что мышиных НМРЛ опухоли exhibit пространственная неоднородность произносится интра опухоль в онкогенные сигнальные деятельности26. Это означает, что использование пространственно различных тканей ломтиками для элементов управления или образцы наркотиков лечение может повлиять на интерпретацию надежных экспериментальных данных, и следовательно тесно прилегающих фрагментов должен использоваться как элементы управления и испытательных образцов. Мы также показали, что во время распространения или онкогенных фосфоропротеид выражение в свежесрезанных uncultured 0 h ломтики были аналогичны в situ опухоли, культивировали срезы показали изменены онкогенных фосфоропротеид выражение, специально измененной p4EBP1 Кроу, а также изменены распространения анализируемой Ki67 IHC. Изменены p4EBP1 выражение аналогично был обнаружен в 24 h человека НМРЛ и рак простаты ломтик культур (Narhi et al., дополнительная цифра S3B-S3C, S5 и S7)26. Эти выводы одобрить, что сравнение культивированный ломтики с их ближайших uncultured фрагмент 0 h имеет решающее значение для оценки сохранения в situ функций опухоли в культивированный ломтиками.

Несмотря на улучшение жизнеспособности organotypic ломтиками25, есть ограничения с системой ротатор с точки зрения технических аспектов. Размещение фрагментов ткани на Титан сетки является более сложным по сравнению с фильтрации вставок и блоком вращающихся инкубации могут быть недоступны. В качестве альтернативы застойные фильтр поддерживает могут быть использованы, но в этом случае только воздух облученных сторону срезы должны быть проанализированы, как воздух фильтр градиенты в жизнеспособности и гипоксии, измеряется HIF1α выражение быстро образуются в поддержке фильтр среза культуры (Дэвис и др., рисунок 5 и Рисунок 7а и 7B)25. Далее мы показали, что опухоль ломтик культур могут exhibit изменены распространения и онкогенные сигнальные деятельности, по сравнению с их родной опухоли26, возможно из-за ранозаживляющим ответы или метаболической адаптации фрагментов для ex vivo культура32. Хотя грубые морфологические особенности опухолей мышиных НМРЛ были сохранены в течение 72 ч культивирования, культуры индуцированной пролиферативные изменения могут повлиять на точной классификации обрабатываемые ломтиков. Таким образом кусочки ткани следует использовать только для краткосрочных функциональных исследований.

Использование блоком вращающихся инкубации по крайней мере частично спасает интра ломтик жизнеспособности или биомаркер выражение градиенты, особенно в течение первых 24 ч культуры. После проверки целостности и функции, это обеспечивает материал ткани для функциональных исследований, например исследований лечения наркотиков. В дополнение к наркологических ответ, изменены конечным выражением, после лечения также могут воспользоваться антитела проверки. Это особенно актуально для обнаружения мышиных epitopes с мышиных моноклональных антител, как эти, как правило, дают высокие окрашивания фона. Кроме того для достижения надежных и воспроизводимых данных в диагностических и клинических параметров требуются хорошо проверенных антител. Таким образом модуляция изобилия или фосфорилирования соответствующей epitopes после медикаментозного лечения в срезах тканей обеспечивает удобный практическое применение в антитела проверки. Основным преимуществом культур кусочек опухоли является способность модели пространственно распределенных функций, включая онкогенные сигнальные деятельности или ответ наркотиков в опухоли или стромальных клеток, что делает их привлекательным ex vivo модель. Однако фрагменты вращаться во время выращивания, и процесс выращивания далее может повредить ткани особенно на краях. Это поэтому сложно точно оверлей биомаркер окрашенных IHC изображения срезов 0 h с некротическими регионами обнаружен искусственный ломтиками, который подрывает способность точно связать пространственные биомаркер деятельности ответ наркотиков. Кроме того опухоль внутренние, культуры индуцированной и лекарственно индуцированные некротические ответы неразличимы по крайней мере в мышиных кусочки ткани НМРЛ, ущерба точный количественный пространственных наркотиков ответов. Наконец использование опухоли ломтик культур позволяет исследователь на тест несколько соединений на же опухоли, без необходимости для лечения животных, таким образом переработки, сокращение и замене экспериментов на лабораторных животных.

Как будущее приложение описанных протокол можно было принять образцы клинических твердые опухоли. Ткани типа зависимые изменения или оптимизации требуются дополнительные вероятно, начиная с корректировки параметров vibratome, включая срез толщины и вибрации скорость оптимизировать эти опухоли текстуру или жесткость. Кроме того питательных веществ и фактор роста требования могут отличаться для различных опухолевых тканей. В качестве примера ломтики рака молочной железы было культивированный с инсулином, дополнена в средних13,18. Учитывая, что ограниченные ткани материал получается во время операции или биопсии, оптимизация опухоли пациента производные ломтик культур может быть сложным из-за трудностей в получении достаточного количества повторных выборок. Кроме того воспроизводимость данных также оспаривается произносится неоднородность пациента к пациенту образца, особенно в процентах опухолевых клеток против фиброзных регионов или стромы инфильтраты, а также компоненты некротических тканей. Наконец применение опухоли фрагменты в диагностических параметров потребует расследование степени наркотиками ответы в ломтик эксплантов предварительной обработки биопсий матчей после лечения в vivo ответов.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследования работы получили финансовой поддержке инновационных лекарств Инициатива совместных действий Грант соглашение no 115188, программу докторантуры Хельсинкского университета в биомедицине стипендий (A.S.N.) и Сигрид Juselius и Орион Farmos основы (E.W.V.). Мы искренне благодарим наших членов консорциума Платформа PREDECT ткани ломтик (Taija Аф Хёльстрём и Siv Knaappila за поддержку в создании системы ротатор и Рику Туркки для поддержки с анализом MATLAB. Сиро Jouko поблагодарил для захвата фотографий на рисунке 1. Мы благодарим FIMM WebMicroscope команды для сканирования гистологические слайды, и поддержки центра лабораторных животных для животноводства.

Materials

Hank’s Balanced salt solution (HBSS) Sigma H6648
Penicillin Streptomycin solution Thermo Fischer Scientific 15140-122
Ham's F-12 medium Thermo Fischer Scientific 21765-037
Glucose VWR 101174Y
FBS Thermo Fischer Scientific 10270-106
Glutamine 200mM Thermo Fischer Scientific 25030-024
Cyanoacrylate adhesive (GLUture) Abbott 32046-90-1
Leica VT1200 S vibrating blade microtome Leica Biosystems 14048142066
Slicing blade VWR PERS60-0138
Titanium grids Albamma Research and Development MA0036
Slice incubation unit Albamma Research and Development MD2500
10 cm tissue culture plate Sarstedt 83.1802
24-well plate Sarstedt 83.1836
6-well plate Sarstedt 83.1839
Neolus Hypodermic Needles Terumo Neolus NN2525R
50 mL falcon tube Greiner  227261
PBS Lonza BE17-517Q
Formaldehyde Fisher F/1501/PB08
Trifold histo cassette paper Cancer Diagnostics DX26280
Histo cassettes VWR 720-2199 
KOS The microwave multifunctional tissue processor Milestone SRL CAT307EN-003
Microtome Thermo Fischer Scientific HM355S
Superfrost Ultra plus slides VWR 631-0099
BSA Sigma A2153
NGS Thermo Fischer Scientific 16210-064
Citric acid Sigma C1909
PT-Module Thermo Fischer Scientific A80400012
Hematoxylin for H&E staining Merck 1.09249.0500
Hematoxylin for counter staining Dako S3309
Eosin Sigma E4382
NKX2-1 antibody Abcam ab133638 Lot Number: GR98031-12
pERK 1/2 antibody Cell Signaling Technologies CST 4370 Lot Number: 17
p4EBP1 antibody Cell Signaling Technologies CST 2855 Lot Number: 20
BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody ImmunoLogic VWRKDPVR-110HRP
Mounting medicum pertex VWR MEDT41-4021-00
DAB  ImmunoLogic VWRKBSO4-110
Dactolisib (NVP BEZ-235) Selleckchem S1009
Selumetinib (AZD2644) Selleckchem S1008
Pannoramic 250 slide scaner 3DHISTECH
MATLAB MathWorks https://se.mathworks.com/products/matlab.html
3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER  3DHISTECH https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer
Adobe Photoshop CS6 Adobe https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s
Fiji-ImageJ ImageJ https://imagej.net/Fiji
CellProfiler CellProfiler cell image analysis software http://cellprofiler.org/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution. Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).
  2. Travis, W. D., et al. The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).
  3. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
  4. Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).
  5. Wright, J. C., et al. Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer. Cancer. 15, 284-293 (1962).
  6. Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. Studies on the organ culture of human tumors. Investigación sobre el cáncer. 26 (4), 626-637 (1966).
  7. Reinbold, R. [Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro]. Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).
  8. Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. [Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects]. Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).
  9. Bousquet, J., Meunier, J. M. [Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis]. Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).
  10. Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
  11. Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
  12. Estes, J. M., et al. Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model. Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).
  13. Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).
  14. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).
  15. Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
  16. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).
  17. Jaamaa, S., et al. DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue. Investigación sobre el cáncer. 70 (21), 8630-8641 (2010).
  18. Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).
  19. Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue. Current protocols in neuroscience. , (2001).
  20. Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture. Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).
  21. Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?. Stem Cells International. , 959807 (2015).
  22. Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
  23. Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
  24. Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement. Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).
  25. Davies, E. J., et al. Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices. Scientific Reports. 5, 17187 (2015).
  26. Narhi, K., et al. Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours. The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).
  27. Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
  28. Nagaraj, A. S., et al. Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1. Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).
  29. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  30. Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).
  31. Hoogt, R., et al. Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project. Scientific Data. 4, 170170 (2017).
  32. Davidson, S. M., et al. Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer. Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).

Tags

Tumor Slice ExplantsPreclinical ResearchDrug Response StudiesMurine Lung TumorsVibratomeHank’s Balanced Salt SolutionEuthanized MouseLungHeartCyanoacrylate Adhesive

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Nagaraj, A. S., Bao, J., Hemmes, A., Machado, M., Närhi, K., Verschuren, E. W. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. J. Vis. Exp. (141), e58569, doi:10.3791/58569 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image