診断テストのための前提条件として外植体腫瘍スライスの樹立と解析

本研究で説明されているすべてのマウス実験、フィンランド国立委員会の動物実験から、ガイドラインに従うことによって行われた、ヘルシンキ大学と州地方の実験動物委員会によって承認されました。南スオミ州 (ライセンス番号 ESAVI/9752/04.10.07/2015) のオフィス。 1. スライス前の準備 以下の資料を準備ができた保つ: vibratome 試料ホルダー、vibratome バッファー トレイ 10 cm 培養プレート、24 ウェル プレート、10 mL ピペット、ピペット少年、ゴミ袋 70 mL のチューブにエタノール消毒器具、組織接着剤。 準備、vibratome: 70% のブレード ホルダーを拭く EtOH、新しい刃を取り付けるし、マニュアル (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf) の指示に従って vibrocheck を実行します。注: それは刃の垂直たわみを最小限に抑え、確実に質の良いスライス vibrocheck ステップを実行することが重要です。 塗りつぶしは各 1 ml のハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) 100 U/mL ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシン (HBSS + P/S); 補足 24 ウェル プレートの氷の上のプレートを保ちます。 F12 文化培と 100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、glutamax 2 mM、22 mM グルコース 10% 牛胎児血清 (FBS) を準備します。注: 腫瘍スライス培養培地および成長因子サプリメント腫瘍組織25によって異なります。 1.4 の手順で説明されているように同じ構図を使用してが、FBS を省略する薬物治療の f12 キー中の必要量を準備します。注: 成長因子培養スライスでがん化シグナルに影響可能性があります、無血清培地は短期薬摂動試験で腫瘍のスライスに推奨します。長期的なスライスの文化を分析し、組織の生存率および未処理スライス培養における腫瘍特異的マーカー発現に及ぼす無血清培地を先に評価することが重要です。 2. 腫瘍肺のコレクション 呼吸の症状は、体重減少率を示すとき頚部転位による担癌マウスを安楽死させます。注: CO2-仲介された安楽死はスライスの生存率または低酸素の応答を引き出すことによる発癌性の活動に影響を与えるかもしれない肺低酸素状態を誘導するために知られています。 胸を露出するよう、すべての 4 つの足で 30 G の針を挿入することで発泡スチロールの蓋の上に euthanized マウスをストレッチします。 皮膚をカット オープン腹部から胸へと首の地域まで。胸郭は、し、肺や心臓を公開するダイヤフラム開いてカットします。組織の損傷を避けるために斜めの位置にはさみをしてください。 一緒に心臓腫瘍肺を解剖し、冷たい HBSS + P/S の 30 mL を含む 50 mL のチューブチューブを冷たい保つため、できるだけ早く次のステップに進みます。注: 肺腫瘍の処理の遅延可能性があります変更 oncogenic 機能、たとえばシグナリング経路の活動。 3 精密カット肺腫瘍の発生をスライスします。 層流フードの内部保持 10 cm 組織培養プレートに HBSS + P/S 担肺を転送します。別の肺葉滅菌はさみや鉗子を使用して、スライスのために表面上の腫瘍に葉を選択します。注: 腫瘍 > サイズ 3 mm スライスに適しています。正常肺組織の剛性の違いによりスライス大きな腫瘍妥協を取り巻く、以来クリア腫瘍領域 vibratome 刃に直面しているような腫瘍組織スライスを受ける正常組織からに区切る必要があります。 滅菌メスで腫瘍を囲む正常肺組織の一部を切断してフラット組織作品表面を生成、シアノアクリ レート系接着剤のドロップのフラット スライドを浸しなさい。腫瘍が直立位置にブレードを向くように、vibratome の試料ホルダーにこちら側をマウントします。せ 2-3 分で乾燥接着剤。注: 試料ホルダーにくぎ付けに正常肺組織、腫瘍組織のスライスとは干渉しないし、正常組織に達する前に停止をスライスします。腫瘍組織は時々 その直立した位置を損なうこと、試料ホルダーにくぎ付けに正常肺組織の海綿状の質により します。このような場合は、直立位置 (図 1 a iii) に腫瘍を保持する取付済の正常肺組織の横にある追加の正常肺サポート組織片を接着します。 金属バッファー トレイに試料ホルダーを配置し、組織はバッファーに浸漬するまで冷たい HBSS + P/S でそれを埋めます。白い氷浴に金属バッファー トレイを置き、スライスしながら組織の冷静さを保つように氷を追加します。 白い氷浴を vibratome に接続します。適切なスライス設定を選択: 0.10 0.14 間速度をスライス 2.5 から 2.8 まで振幅 ms と 160-250 μ m まで切削厚さ。メモ: スライスの設定は、組織の硬さに応じて調整する必要があります。硬組織は柔らかい組織よりもスライスしやすく、柔らかい組織は、低い速度でスライスが必要です (0.1-0.12 ms) と高い振幅 (2.6 〜 2.8)。4-5 mm の大きな腫瘍は通常 15-20 200 μ M の厚さのスライスを提供します。短期栽培の層流フードの外準無菌条件下でマウスの腫瘍をスライスできます。ただし、臨床腫瘍はヒト組織における可能な感染性微生物への暴露を避けるためにクラス II バイオ層流フードの内部常にスライスする必要があります。 滅菌鉗子を使用して、密接にスライス、スライスした順序の追跡氷の上開催 24 ウェル プレートの別の井戸で HBSS の 1 mL にスライスを収集します。各マーク実験計画に従って 24 ウェル プレートのも。たとえば、マーク シーケンシャル井戸 24 ウェル プレートの文化時点、または 0 h、車両制御 (C) として薬物治療 (T) (図 1 b ii) です。注: いない邪魔か、スライスを収集しながら腫瘍を引いてその後スライスの厚さで不整合が生じて、ブレードの角度に対して腫瘍の方向が変更されます。 すべてのスライスを収集すると、チタン グリッド (グリッドあたり 2-3 スライス) ウェルあたり培養液 2.5 mL を含む 6 ウェル プレートの配置にそれらを転送します。チタン グリッドと媒体との間に気泡が形成されることはないことを確認します。 グリッドにスライスをロードし、斜め位置に 6 ウェル プレートを保存媒体の部分をカバー、グリッド、グリッドの中にスライスを配置するにはそれはカールする場合スライスを広げるためには、鉗子を使用します。95% の空気と 5% CO2、37 ° C で維持される加湿インキュベーター内に配置、回転のインキュベーション ユニットに 6 ウェル プレートをロードし、(図 1 i ii) の回転サイクルを開始します。注: 金属グリッドと 6 ウェル プレート回転ユニットの電源を入れる前にバランスのとれた体重を正確にする必要があります。グリッドの中央のスライスを配置することが重要だ、彼らは完全に空気と回転サイクル中に液相を切り替える。低すぎたり高に置かれているスライスは、酸素または組織存続を危険にさらすことができます (図 1 私栄養素に適切には公開されません。スライスすることができます時折スライド ダウン スライスの位置をグリッドの栽培中に従うことが重要です。文化発症 1-2 時間以内場合は、その位置を修正し、このサンプルが壊れていることを注意してください。組織の生存率が不適切な酸素および栄養供給によって著しい影響を受けると、長期間の適合がスライスを破棄しなければなりません。 0 h、教養、参照として培養スライスに隣接する組織スライスを収集します。トップ、中間、スライスされる組織の中心を表すために少なくとも 3 つの参照スライスを収集します。5.1 で説明するようすぐに 0 h スライスとプロセスを修正します。メモ: スライスの数が限られている場合など、複数の化合物の治療または技術的なレプリケートを行うとその隣の 0 h サンプルを各処理のサンプルの比較難しくなります。このような場合、相対的な組織の生存率または文化発症に関連するマーカーの発現を評価する最も近い 0 h スライス (少なくとも 400-600 μ m 離れて) を使用します。 長期栽培は、毎日培養液を補充するため。滅菌鉗子を使用して組織スライスを含むグリッドを持ち上げて 6 ウェル プレートの空のウェルに配置新鮮な培養液を培地の 70% を置換し、媒体に戻ってグリッドを配置します。3.6 の手順で説明したように回転サイクルを続行します。 4. 小分子阻害剤による腫瘍片の治療 治療中の化合物の必要な濃度を準備します。通常、培養細胞の測定 IC50s と比較して 10 倍高い薬物濃度は、ターゲット組織スライス抑制を達成するために必要です。非特異的細胞傷害を避けるためには、各化合物の最小有効濃度を取得する濃度の範囲をテストします。ここでは、我々 は 0.1-1 テスト PI3K/mTOR 阻害剤 dactolisib と 0.05-0.5 の μ M のマウスの非小細胞肺癌のスライスに MEK 阻害剤 selumetinib μ M。 6 ウェル プレートに希釈薬、DMSO または他の車両制御とメディアの 2.5 mL を追加します。井戸にチタン グリッドを配置します。 手順 3.6 でグリッド上に組織のスライスを配置します。 ティッシュの固定とパラフィン セクション 5 で説明されているように、スライスの処理 24 時間進むの車両や薬物治療を実行します。注: 薬物治療の期間を最適化できます実験の目的に応じて組織機能の in situ培養期間中に分析を保持する組織スライスの能力を考慮しました。 5. 固定と組織スライスの処理 教養 0 h 参照または PBS に浸したろ紙上に培養スライスを慎重に持ち上げます。 これを行うには、10 cm のプレートで 2-3 mL の PBS を追加、PBS でスライスのフロートを聞かせて、’魚’ それ鉗子のペアを持つフィルター紙の上にスライスを持ち上げることによってです。 フィルター ペーパーを histocassette に転送し、明らかに後続処理ステップ (図 1) の中にスライスの位置をマークする組織スライスの上に希釈したヘマトキシリン (脱イオン水 1:1) のドロップを追加します。 カセットを閉じて 4% 中性緩衝ホルマリン液にそれを転送します。4 ° C で一晩組織を修正します。注: フィルター紙の上にスライスを配置しながらスライスの最上部のセクションが上向きに直面していることを確認してください。これ断面および分析手順 6.3 中に上部、中間、およびスライスの下のセクションに従うことが必要です。 次の日は 70% にカセットを転送エタノール、パラフィン包埋組織処理手順にすぐに進むと。 ティッシュの処理の前に 100% に、histocasettes を洗ってエタノール 2 x 10 分。この場合、ティッシュの処理のため電子レンジ駅を使用します。1 mm 厚に使用されるプログラムを選択、マニュアル (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf) の指示に従ってください。注: 加工機その他の組織を使用するときは、薄い組織サンプルに適したプログラムを使用します。 パラフィン包埋用、histocassette を開き、フィルター ペーパーからスライスを持ち上げながらメスを使用します。フィルター紙を破棄し、流動パラフィンを含む鋳型にスライスを転送します。 例えばも断面を確保するためのフラットの重量と、埋め込み型の底面に対して組織を押します。金型の上に histocasette の底の部分を置き 30 分冷たいパテに金型の涼しい許可しなさいパラフィン ブロックから金型を分離します。注: 水平埋め込む代わりに、垂直に直立位置でスライスを配置することで腫瘍のスライスを埋め込むことが可能です。垂直部分は容易に生存率または単一のセクション25機能マーカー式のグラデーションの解析を許可します。水平方向に埋め込まれたスライスとグラデーションの分析には、パラフィン切片作製手順 6.2 で説明が必要です。 6. 処理と (FFPE) に解析ホルマリン固定、パラフィン包埋組織 ミクロトームを使用して FFPE 組織スライス ブロックの 4 μ m の薄いセクションを準備します。断面しているとき、ブロックの角度を調整、ブロックの表面がブレード; に対して水平方向これもセクション組織全体を取得する必要です。 培養スライスのスライス、またはグラデーション バイオ マーカー式の間で文化による生存率の電位勾配、細胞遊走のキャプチャを有効にするには、各組織スライスのトップ、センター、下のレイヤーからオブジェクトのスライドのセクションを収集する.下記のとおり。 パラフィン包埋組織スライスの連続切片をスライド ガラスの上の部分に最初に集め。(図 1E) スライド ガラスの下の部分が続く中央に深い組織層のセクションを収集を継続します。注: スライド ガラス上の 3 つのセクションに合わせて、トリム パラフィン埋め込まれた組織スライスを周囲の過剰。 37 ° C で一晩乾燥してセクションを許可する、下記のとおり H & E 染色や免疫組織化学的に進みます。注: 高温や長時間の FFPE のセクションが格納されているとき、抗原の消失する場合が生じる。パラフィン セクションが 4 ° C で保存する推奨され、IHC 解析をセクショニング後 6 ヶ月以内に実施されなければなりません。 H & E 染色、deparaffinize およびパラフィン セクションを次のように水分補給: キシレン 3 x 5 分、100% エタノール 3 x 1 分、96% の江藤 2 x 1 分、70% のエタノール 1 x 1 分と脱イオン水 2 1 分 x。 酸アルコールのセクション 5 分ディップのため水道水を実行して下させたてフィルター ヘマトキシリン液, 10 分間のセクションを孵化させなさい (1% 70% の塩酸エタノール) 2 回の 5 分の 2 m の 0.5% エオシンと孵化によって続いての水道の流水下で洗浄で。 アルコール、キシレン溶液中のスライドを次のように浸すことによってセクションを脱水エオシン ステップを次: 96% EtOH 2 15 x s、100% エタノール 3 30 x s、キシレン 3 1 分の x。最後に、セクションを埋め込むキシレン ベース取付中。 7. 組織生存率とバイオ マーカーの発現の解析 高解像度の画像を取得するには、H & E 染色スライド スキャナーを使用してすべてのスライドのスキャンを生成します。組織の実行可能性を評価するためにスライスの上、中、下のセクションを表す組織のスキャンからのスナップショットを取る。 マニピュレーターの写真のソフトウェアを使用して、手動で MATLAB を使用して壊死領域の定量化に続いて、組織の壊死領域にマスクを描画します。 異なる時間ポイントでは私たちの以前の研究 (Närhi et al., 図 S2BとC)260 h スライスに最も近い比較栽培スライスの相対生存率を計算します。同様に、培養スライスの上、中間および底で生存率を定量化することで潜在的なイントラ スライス生存率勾配を評価し、その最も近い 0 h スライスに各セクションの相対生存率を計算します。注: マウスの非小細胞肺癌のスライスの単なる栽培は、壊死性細胞死を誘導する、間前のヴィヴォ培養条件に対する生体の応答は腫瘍組織によって異なります。たとえば、HIF1α、ER、および F4/80 でマークされたマクロファージのグラデーションは乳房がんモデル25から派生したフィルターでサポートされているスライス培養で検出されました。したがって、H & E-だけでなく、培養スライスの IHC に基づく分析は組織の種類ごとに考慮する必要があります。 パラフィン セクションの IHC を実行します。以下 IHC プロトコルは開始ポイントを他の抗体のための最適化がさらに必要があります。簡潔に、deparaffinize し、パラフィン セクションを次のように水分補給: キシレン 3 x 5 分、100% エタノール 3 x 1 分、96% のエタノール 2 x 1 分、70% のエタノール 1 1 分と脱イオン水 2 の x 1 分 x。 通常ヤギ血清 (NGS) 周囲温度 (21-23 ° C) で 30 分の 1 × PBS で 1% ウシ血清アルブミン (BSA) と 10% ブロックすることによって続いて抗原エピトープを公開し、ph 6 PT モジュールで 10 mM クエン酸を使用して熱を介した抗原検索を実行します。 1 %bsa と 5% で希釈した一次抗体の孵化 NGS 1 × pbs は、周囲温度 1-2 h のいずれか。3, 3 ‘-ジアミノベンジジン (軽打) を用いた検出に続いて、周囲温度で 30 分間、抗家兎の二次抗体とインキュベートします。 セクションは 30 s、5 min のとおりアルコール、キシレンのソリューションでスライドを浸すことによって脱水が続くため水道水で洗浄、ヘマトキシリン (1:10 に脱イオン水で希釈) と counterstained: 70% EtOH 1 96% x x、100% エタノール 2 エタノール キシレン 3 x (× 31 分ステップ)。最後に、セクションを埋め込むキシレン ベース取付中。 IHC 染色スライドのスライド全体スキャンを取得、画像ビューアーを使用して、1:4 の倍率で TIFF 画像としてエクスポートし、ImageJ を用いた数量を実行します。注: スキャナーに代わる、20 倍または 40 倍の倍率での顕微鏡画像は、数量の取得ことができます。定量化する; マーカーによって画像の倍率を選択できます。細胞質中に核染色に高倍率画像お勧めします。 または 20 倍画像を用いて膜マーカーを定量化することができます。 核マーカーの定量化, この場合 NKX2 1 式フィジー-ImageJ を使用して 16 ビット画像を各画像に変換し、画像解析用の画像をアップロードします。 分析によってイメージ解析パイプラインをカスタマイズします。このプロトコルでは NKX2 1 肯定的な核の定量化のため次のパイプラインを使用して、:を識別するプライマリ オブジェクト |オブジェクトの強度を計測 |オブジェクトをフィルター処理 (最小値 = 0.0025) |計算理学結果は DAB 染色核原子核の総数の割合として表されます。