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Biología

LDL 콜레스테롤 이해 분석 결과 라이브 셀 이미징 분석 셀을 사용 하 여 상태 모니터링

Published: November 17, 2018
doi:
10.3791/58564
, , , , ,
1Interdisciplinary Stem Cell Institute,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiology,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Pharmacology,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 4Dr. John T. Macdonald Foundation Department of Human Genetics,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 5John P. Hussman Institute for Human Genomics,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 6Department of Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism and Endocrinology and the Diabetes Research Institute,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 7Vascular Biology Institute,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 8Peggy and Harold Katz Family Drug Discovery Center,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine

Summary

이 프로토콜에는 라이브 셀 이미징 다양 한 셀 형식에 시스템을 사용 하 여 실시간으로 유입 속도와 LDL 콜레스테롤 흡수를 측정 하는 효율적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 세포 형태학 및 그러므로 잠재적인 세포 독성에 대 한 모니터링 하면서 LDL 유입에 영향을 미치는 화합물의 약리 활동 화면 플랫폼을 제공 합니다.

Abstract

LDLR 중재 된 endocytosis 통해 LDL 콜레스테롤 흡수의 규칙은 대사 장애, 심혈 관 질환, 신장 질환 등 다양 한 주요 병 리에 연구의 중요 한 영역 이다. 현재, 동시에 세포의 건강에 대 한 모니터링 하면서 LDL의 통풍 관을 평가 하기 위해 사용할 수 있는 방법이입니다. 현재의 연구는 세포 건강에 대 한 동시 모니터링 LDL 유입의 연속 측정을 얻으려고 라이브 셀 이미징 분석 시스템을 사용 하 여 프로토콜을 제공 합니다. 이 새로운 기술은 3 개의 인간 세포 라인 (간장, 신장 관 상피, 그리고 관상 동맥 내 피 세포)에 4 시간 과정을 통해 테스트 됩니다. 또한,이 기술의 감도 잘 알려진 LDL 흡수 억제제, Dynasore 및 재조합 PCSK9 단백질 뿐만 아니라 LDL 글귀 발기인, Simvastatin으로 유효성이 검사 됩니다. 함께 찍은이 메서드는 동시에 차단 약리 활동 뿐만 아니라 세포 형태학, 따라서의 LDL 유입 규제 하는 화합물의 세포 독성 모니터링 매체 높은 처리량 플랫폼을 제공 합니다. 분석 다른 이미징 시스템 및 분석 소프트웨어와 함께 사용할 수 있습니다.

Introduction

낮은 밀도 지 단백 수용 체 LDLR 중재 LDL endocytosis은 순환 LDL 콜레스테롤 다양 한 염증 성 뿐만 아니라 심혈 관 질환1, 신장 질병2 의 코어에 때문에 연구의 중요 한 영역 질병3 고 콜레스테롤 전송 유전자4,5,,67에 돌연변이와 유전 질환. LDLR 중재 콜레스테롤 유입에 연구 등 화학 Dynasore8,,910로 LDL을 규제 하는 Dynamin 억제제 등 여러 연구 도구의 식별 이어졌다 단백질 Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin 등 9 (PCSK9)11,12를 입력합니다.

LDL LDLR endocytosis 통로 봉쇄 clathrin 입히는 구 덩이13으로 세포 표면에 LDL LDLR 복잡 한 시작 합니다. 소포는 다음 셀 내부 전송에 대 한 그들의 LDL LDLR 단지 internalizing 세포 표면 막의 invagination에 의해 형성 됩니다. 형성된 기 초기와 다음 늦은 endosomes로 성숙, pH14의 수용 체 LDL의 분열을 일으키는 늦은 endosome 내부 삭제 합니다. 과거에는, LDL 유입의 정량화 방법 라디오 라는 125-LDL 공동 화 세포와 부 량15셀에서 라디오 이라는 단백질의 후속 추출에 의존. 이 다음 붙일 이라는 LDL 단백질 DiI LDL 및 후속 immunostaining 등의 사용 또는 분 광 광도 계 또는 플레이트 리더15,16를 사용 하 여 형광 판독을 위한 단백질의 추출에 의해 대체 되었다. 붙일 셔 서 LDL도 사용 되었습니다 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 LDL과 세포 표면 LDL 바인딩17의 국제화의 분석을 위해. 이러한 메서드는 치료 후 데이터의 수집에 대 한 허용, 치료 하는 동안 세포의 생존 능력을 모니터링 수는 없습니다.

후반 endosome의 산 성 pH는 pH 활성화 형광 LDL 프로브 pHrodo 국제화18,19후 fluoresces 레드 LDL 등의 사용 수 있습니다. 이 속성은 라이브 셀에 LDL의 통풍 관 평가의 연속 시간 과정에 대 한 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜 pHrodo 레드 LDL 형광 이미징 셀 건강에 대 한 동시 모니터링 측정 LDL 이해 순차적으로 살아있는 세포 분석에 활용 합니다. 3 다른 인간 세포 선, 인간 간 암 (HepG2) 세포, 인간 신장 상피 (HK2) 세포 및 인간의 관상 동맥 내 피 세포 (HCAEC에 4 시간 걸쳐 테스트 결과이 새로운 기술은의 신뢰성을 나타냅니다. ). 이러한 셀 라인은 LDL 클리어런스20,21,22,23,,2425,26,27 임상적으로 중요 한 , 신장 질환28,,2930,31및 심장 질환32,33, 각각. LDL 유입 모니터링 이외에이 프로토콜 LDLR 식 및 LDL 통풍 관, simvastatin의 스타 틴 유도 뿐만 아니라 두 개의 잘 알려진 LDL 흡수 억제제, Dynasore 수화물 및 재조합 PCSK9 단백질 치료를 통합. Dynasore 및 재조합 PCSK9 각 LDL의 통풍 관을 줄이기 위해 다른 경로 통해 작동 합니다.

Dynasore는 Dynamins10 의 작은 분자 억제 물 이며 LDL LDLR 복잡 한10,34의 clathrin-종속 endocytosis를 차단 하 여 LDL의 통풍 관을 감소 시킨다. 재조합 PCSK9, 다른 한편으로, 이다 peptidase LDLR에 바인딩하고 필요한 구조적 변경35,36 차단 하 여 내 면된 복잡 한에서 LDL를 해제 한 후 세포 표면에 그것의 재활용을 억제 S8 가족의 구성원 . 결국 감소 셀 표면 LDLR 밀도 감소 된 LDL의 통풍 관에 셀에 의해 지도 한다. 스타 틴, 직접 3-히 드 록 시-3-methylglutaryl-코엔자임 (HMG-CoA) reductase 효소와 따라서 콜레스테롤 생 합성을 차단 하는 동안 또한 알려져 있습니다 upregulate LDLR25,38 증가 LDL의 통풍 관에 이르는 표현. 이 프로토콜의 감도 3 임상 관련 인간 세포 선, HK2, HepG2, HCAECs, Dynasore 및/또는 재조합 PCSK9, LDL 유입 및 HepG2 세포에 의해 통풍 관 LDL에에서 표시 된 증가에 상당한 감소를 감지 하 여 유효성을 검사합니다 셀 형태/건강에 대 한 모니터링 4 시간 코스에서 Simvastatin. 함께 찍은,이 메서드는 동시 상영 약리학 활동과 라이브 셀에 LDL의 통풍 관을 통제 하는 화합물의 세포 독성에 대 한 중간-높은 처리량 플랫폼을 제공 합니다.

Protocol

1. 시드 24-잘 접시에 셀 셀에서 미디어를 발음, Dubelco의 인산 염 버퍼 염 분 (dPBS)의 5 mL로 세포 세척 하 고는 dPBS 발음. 100 mm 접시에 HepG2 세포에 대 한 0.25%의 1.5 mL를 사용 하 여 트립 신/EDTA, HK2 셀 또는 HCAECs를 사용 하 여 0.05 %Trypsin / EDTA 용액의 1.5 mL는 세포를 분리 하 고. 세포 분리 될 때까지 또는 4 분 동안 37 ° C 배양 기에서 접시를 품 어. HCAEC 셀 HepG2 및 HK2 또는 트립 신 솔루션, dPBS 플러스 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 중화의 3 mL에 대 한 완전 한 미디어의 3 mL를 추가 하 여 4 분 부 화 후 트립 신 중화. 15 mL 원뿔 튜브로 셀을 전송 하 고 5 분 동안 250 x g에서 원심, 미디어, 발음 다시 완전 한 미디어에 셀 펠 릿을 중단. 부드럽게 헤어 셀 덩어리 40 μ m 메쉬 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 스 트레이너를 통해 세포를 씻지 마십시오. 셀을 계산 하 고 최적화 된 밀도에 접시. 예를 들어 5000 세포 HepG2 세포 또는 HK2 셀 또는 HCAECs의 24-잘 접시에 잘 당 10000 세포의 당 최적의 결과가 발생할. 연결할 셀 수 있도록 37 ° C에서 하룻밤 접시를 품 어. 다음 날, 5% 플러스 미디어 (FBS) 없이 셀 라인에 대 한 기본 셀 미디어 변경 Lipo 단백질 결핍 혈 청 (LPDS) 또는 낮음 (2%) 치료에 따라 FBS 미디어 (1.7 참조). 다음, 계속 굶 어 셀 24 h에 대 한 보육. 총 미디어의 500 μ를 사용 하 여 24-잘 접시에 잘 당. 세 가지 방법 중 하나로 세포 치료: 10 µ g/mL의 rPCSK9 (또는 차량)를 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C 배양 기에 셀 Dynasore 수화물 (또는 차량, 디 메 틸 ⁚) 40 µ M를 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C 배양 기에 셀을 반환을 반환 또는 1 µ M Simvastatin (또는 차량, 디 메 틸 ⁚)를 추가 하 고 12, 18 또는 24 시간 동안 37 ° C 배양 기에 셀을 반환. 미디어를 사용 하 여 5% LPDS rPCSK9 또는 Dynasore 치료. 낮은 사용 (2%) FBS 미디어 또는 미디어 5% LPDS Simvastatin 치료.참고: 당시 미디어 변화의 지 기아 (1.6 단계)에 대 한 장기 실험 또는 분석 전에 단기 실험에 대 한 수행할 수 있습니다 원하는 화합물과 세포 치료. 또는, 사용자 지정 된 치료 시간 형식과 실험의 목적에 따라 선택할 수 있습니다. 다음, 10 µ g/mL의 최종 농도 얻기 위해 각 잘 하 pHrodo 레드 셔 서 LDL (재고 1 mg/mL)의 5 µ L를 추가 합니다. 다음, 조심 스럽게 우물에서 어떤 거품 제거. 2. 살아있는 세포 분석 이라는 LDL를 추가한 후 즉시 살아있는 세포 분석 시스템 인큐베이터에 접시를 놓고 ( 재료의 표참조) 접시 접시에 결로 줄이기 위해 15 분 동안 equilibrate를 허용 하 고. 한편, 소프트웨어를 열고 접시를 들고 배를 추가 하 여 스캔을 예약 합니다. 잘 10 배 단계 및 빨강 채널을 사용 하 여 4 시간에서 1 시간 간격 당 이미지 16 이미지. 데이터 처리에 사용할 접시 지도 만듭니다. 속성 탭에서 클릭 판 지도선택 합니다. 셀 유형 및 치료 화합물 탭에 입력 합니다. 영역 탭에서 클릭 합니다 복제의 각 집합을 선택 하 고 영역으로 저장. 3. 분석 매개 변수 설정 실험 실행 완료 되 면 이미지 설정에서 만들 훈련 척도 계산 집합에 포함 된 각 매개 변수를 컴퓨터 소프트웨어. 소프트웨어에서 접시 보기 열고 분석 작업 유틸리티 상자에서 만들기 또는 이미지 컬렉션에 추가선택. 새 이미지 컬렉션을 선택 하 고 이미지 컬렉션에 대 한 이름을 입력 채널 옆에 있는 상자를 선택 하 여 빨간색 과 위상 채널을 선택 합니다. 5 더 많은 이미지를 선택 하 고 현재 이미지 컬렉션에 추가 하 여 이미지 컬렉션에 추가 합니다. 셀에 대 한 처리 정의 만듭니다. 표 1 이 LDL 유입 프로토콜에 대 한 정의 처리 HepG2, HK2, 및 HCAE 세포에 대 한 매개 변수를 포함 합니다. 분석 작업 유틸리티 상자에서 새로운 처리 정의선택 합니다. 2.1.2 드롭 다운 메뉴에서에서 단계에서 라는 이미지 컬렉션을 선택 합니다. 표 1에서 세포의 유형에 대 한 매개 변수를 입력 합니다. 미리 보기 상자에서 드롭 다운 메뉴를 사용 하 여 미리 보기 모두를 선택 하. 분석 마스크 상자에 처리에 대 한 분석에 포함 된 영역을 볼 수 합류 마스크 와 레드 개체 마스크 상자를 확인 합니다. 그림 1을 참조 하십시오. 셀과 LDL 마스크에 포함 되도록 이미지 컬렉션을 스크롤하십시오. 선택 파일 처리 정의 저장 합니다. 실험 실행에서 이미지의 집합을 분석 합니다. 실험 접시 보기에서 엽니다. 분석 작업 유틸리티 상자에서 시작에 대 한 새로운 분석 작업을 선택 합니다. 저장된 처리 정의 선택 합니다. 분석 작업 이름을, 분석에 대 한 시간 범위를 선택 하 고 분석 실험 우물을 강조. 시작 단추를 클릭 합니다. 4. 분석 및 데이터 처리 분석 작업이 완료 되 면 데이터를 내보낼: 완성 된 분석을 선택 하 고 보기를 누릅니다. 유틸리티 메뉴에서 통계/그래프 내보내기를 선택 합니다. 영역 메뉴에서 선택 모든 우물, 그리고 그룹 메뉴에서를 그룹으로 우물의 각 집합에 대 한 평균 값 복제 선택한 내보내기 각 잘에 대 한 개별 값 없음을선택. 레드 개체 통계 메뉴에서 총 레드 개체 통합 강도 (RCU x µm2/image)을선택 합니다. 이 매개 변수는 세포에 의해 총 LDL 글귀에 해당 각 잘 걸쳐 빨간 신호 강도 (RCU)에 번의 합 모든 이미지에 (µ m2)에 빨간 신호 영역을 나타냅니다. 데이터 내보내기 버튼을 클릭 합니다. 데이터를 개별 이미지 뜨확인 합니다. 데이터는 자동으로 클립보드에 복사 하 고 새로운 스프레드시트 파일에 붙여 넣을 수 있습니다. 단계 개체 통계 메뉴에서 합류 (%)을선택 합니다. 데이터를 개별 이미지 뜨확인 합니다. 데이터 내보내기 버튼을 클릭 합니다. 데이터는 자동으로 클립보드에 복사 하 고 총 레드 개체 통합 강도 데이터가 포함 된 스프레드시트 파일을 복사할 수 있습니다. 다음 방정식으로 전체 면적 백분율 합류의 변환을 적용 됩니다.총 단계 면적 (µ m2/image) = 합류 (%) × (이미지 높이 (픽셀) × 해상도) × (이미지 너비 (픽셀) × 해상도)참고: 합류 (%) 매개 변수는 각 음에 셀의 영역에 해당 하는 이미지 당 단계 영역의 백분율 합류를 나타냅니다. 이 메트릭은 각 개인에 대 한 총 단계 영역으로 변환 되어야 한번 내보낸 이미지. 이미지 사양 단계 채널 (이미지 높이, 폭 및 해상도) 각 실험 선박에 대 한 위의 수식을 사용할 수에 대 한 이미지 채널에서 선박 속성 을 참조 하 여 찾을 수 있습니다. 4.1.6 우물에서 셀 밀도 변화를 제거 하기 위해 각 개별 이미지에 대 한 다음 수식을 사용 하 여에서 계산한 총 단계 지역에 총 레드 개체 통합 강도 정상화. 이미지 당 LDL 글귀 (RCU) 값의 해당 총 단계 지역 (µ m2/image) 각 이미지의 총 레드 개체 통합 강도 (RCU x µm2/image) 값을 나눕니다. 그런 다음, 각 잘 각 잘에서 평균 LDL 글귀 다음 그룹 의미를 모든 복제 우물의 LDL 통풍 관 값을 평균 하의 모든 이미지의 LDL 글귀 (RCU) 데이터 평균. 이러한 데이터 최종 LDL의 통풍 관 값 이며, 일러스트 레이 션 및 선택의 소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석에 사용 될 수 있습니다.

Representative Results

라이브 셀 이미징 3 인간의 세포 라인에 콜레스테롤 유입 연구 기간 동안 세포 건강의 신뢰할 수 있는 모니터링 가능우리는 콜레스테롤 항상성 조절 역할을 주요 병 태 생리, 인간 간 암 (HepG2) 셀, 인간 신장 상피 (HK2) 세포, 및 인간 관상 동맥 내 피 세포를 포함 하 여 3 개의 인간 세포 라인에 우리의 분석 결과 검증 (HCAECs)입니다. 우리 사용 라이브 셀 이미징 시스템 LDL 이해 분석 결과 직렬 측정 h는 4 시간 코스에서 1 시간 간격. 우리의 결과 테스트 하는 모든 셀 종류가 새로운 기술과 최종 끝점 (그림 2) 4.33 h 유입 연구 기간에 대 한 지속적인 LDL의 통풍 관을 나타내는 곡선에 결과와 호환 했다 나타냅니다. 그림 2 에 표시 된 유입 데이터 총 pHrodo 빨간색 표시 된 LDL 형광을 정상화 하 여 얻은 했다 (붉은 개체 통합 강도 RCU x µm2에 이미지 당 총/이미지) 각 이미지의 각 잘 (μ에 이미지 당 단계 개체 영역에서 총 셀 영역을 m2/image) 우물에 걸쳐 셀 밀도 변화를 제거 하. 또한, LDL 콜레스테롤 통풍 관에 영향을 미치는 화합물을 심사 하기 위해 LDL 유입 분석 결과의 감도 검증 하려면 우리 사용 LDL 유입, Dynasore 및 rPCSK9, 억제 하기 위해 알려진의 긍정적인 컨트롤 두 개 및 LDL을 유도 하는 것으로 알려져 한 긍정적인 제어 이해, Simvastatin Dynasore와 rPCSK9, 치료 다음과 우리의 결과 검증으로 모든 3 테스트 4 h 시간 과정 (그림 2A-C)을 통해 LDL 유입에 상당한 감소를 보여주었다 인간의 세포 라인 (HepG2, HK2 및 HCAEC). 예를 들어 그림 2A 셀; DMSO로 치료에 비해 시간 동안 Dynasore의 치료 HepG2 세포에 LDL 유입 감소는 보여준다 Dynasore 제어 했다 치료 제어 그룹에 비해 LDL 유입에 아무런 상당한 영향에 대 한 차량 제어로 DMSO 하면서. 게다가, 우리의 연구 결과 HepG2 세포 Simvastatin (그림 3)와 치료 다음과, LDL 유입에 상당한 변경 감지를이 방법의 감도 지원 하 여 LDL의 통풍 관에 표시 된 증가 보여주었다. LDL 통풍 관 연구에서 일반적인 시간 포인트 4.5 h 시간 포인트에 대 한 LDL 유입은 크게 감소 Dynasore 또는 rPCSK9 치료 고 Simvastatin 치료 (그림 4)에 의해 증가. 라이브 셀 이미징 LDL 이해 연구를 사용 하는 주요 장점은이 시스템에 각 잘 시험된 화합물의 잠재적인 세포 독성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 셀의 실시간 이미지를 제공 한다. 그림 5-7 net LDL 유입에 대 한 시각적 참조로 초기 시간 포인트 (0.33 h) 및 최종 끝점 (4.33 h) 조사 3 셀 라인의 대표 이미지를 보여 줍니다. 이미지는 다음 Dynasore 또는 rPCSK9 치료, 효과 이러한 화합물의 안전성을 나타내는 세포의 정상적인 형태를 확인 합니다. 살아있는 세포 분석 제공 신뢰할 수 있는 직렬 양적 콜레스테롤 유입 측정 다양 한 트리 트 먼 트 이 프로토콜을 사용 하 여 라이브 셀 이미징 시스템의 가장 큰 장점은 시간 과정 전반에 걸쳐 데이터를 수집 하 고 비교 한 마지막 시간 지점으로 전통적으로 수행 보다는 여러 시간 포인트에서 LDL 유입의 수입니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리 계산 백분율 reductionin LDL 유입 시간 과정을 통해 1 시간 간격 뿐만 아니라 터미널 시간 지점에서 수 있습니다. 표 2 에 요약 되어 40 µ M와 10 분 사전 치료 다음과 3 테스트 인간의 세포 라인에 LDL 유입 감소 Dynasore 또는 1 h 10 µ g/mL rPCSK9 사전 치료. 최종 연구 종점으로 4.33 h, 40 µ M에 Dynasore 치료 53%, 68%, 54%, 각각 (표 2A-C) 로 HepG2 세포, HK2 세포와 HCAECs에서 LDL 유입 감소와 LDL에 55% 감소 귀착되 었 다 rPCSK9 10 µ g/mL에서 치료 HK2에서 유입 세포 (표 2B). 전통적인 분석에서 터미널 시간 포인트 측정, 뿐만 아니라 우리는 실험의 각 시간 지점에서 치료 때문에 LDL 유입의 감소에 정량 분석을 수행 수 있습니다. 예를 들어 테이블 2B 치료 셀 1.33 h에서 79%, 2.33 h 67%로 LDL의 통풍 관의 감소 귀착되는 HK2에서 rPCSK9, 3.33 h 59% 게시물 치료 치료 세포에 비해 보여줍니다. 이 프로토콜 치료 후 LDL 유입의 정량 분석에 대 한 신뢰할 수 있는 메서드를 제공합니다. 그림 1 : 정의 마스크 처리. HK2 셀의 대표 이미지 ( 표 1에 자세히 설명) 적절 한 처리 정의의 응용 프로그램에 따라 묘사 된다. 레드 개체 마스크 적용 (C), 또는 단계와 레드 개체 마스크 적용 (D) 단계 Maskapplied (B)와 (A), 마스크 없이 areHK2 셀을 표시. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : 감소 LDL 통풍 관을 사용 하 여 라이브 셀 이미징 시스템 4.33 h 시간 걸쳐. 라이브 세포 분석 시스템은 LDL 유입 인간 간 암 (HEPG2) 셀 (A), 인간의 신장 관 상피 (HK2) 셀 (B), 그리고 인간의 관상 동맥 내 피 (HCAE) 세포 (C)에서 측정 하는 데 사용 됩니다. 셀 긍정적인 컨트롤 Dynasore (실행 하기 전에 10 분) 또는 rPCSK9 (1 시간 실행 하기 전에)으로 치료 했다. DMSO는 Dynasore 처리를 위한 차량으로 사용 되었다. 긍정적인 통제는 크게 모든 3 셀 라인에서 LDL 유입 감소. LDL 유입 값 총 단계 개체 영역 (µ m2/image) 총 빨간색 개체 통합 강도 (RCUxµm2/image)을 정상화 하 여 얻은 했다. 데이터는 mean±SEM. N = 6 웰 스/그룹. 데이터는 2 또는 3 독립적인 실험의 대표. p < 0.0001 vs 빈, 그리고 #p < 0.0001 vs DMSO, 양방향 ANOVA를 사용 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 . 라이브 셀 이미징 4.33 h 시간 과정을 통해 시스템을 사용 하 여 LDL 통풍 관에 증가. 라이브 세포 분석 시스템 LDL 유입 인간 간 암 (HEPG2) 셀에 측정 하는. LDL의 통풍 관은 크게 치료 Simvastatin 12 h (A), 18 h (B), 또는 24 h (C)에 대 한 2%를 포함 하는 미디어를 사용 하 여 다음 증가 FBS. 24 시간 포인트 5%를 포함 하는 미디어도 수행한 LPDS (FBS) 없이. DMSO는 부정적인 제어로 사용 되었다. LDL 유입 값 총 단계 개체 영역 (µ m2/image) 총 빨간색 개체 통합 강도 (RCU x µm2/image)을 정상화 하 여 얻은 했다. 데이터는 mean±SEM. N = 6 웰 스/그룹. 데이터는 하나의 독립적인 실험의 대표. p < 0.0001 대 DMSO, 스튜던트 t-검정을 사용 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 . 4.3 h 시간 지점에서 LDL 통풍 관을 낮추는 대리인에 의해 중요 한 LDL 유입 감소. LDL 유입은 인간 간 암 (HepG2) 셀 (A), 인간의 신장 관 상피 (HK2) 셀 (B), 그리고 인간의 관상 동맥 내 피 (HCAE) 세포 (C) LDL 글귀와 치료 다음과 크게 감소 억제제 Dynasore 10 분 또는 1 시간 동안 rPCSK9. LDL 유입 후 12, 18 또는 24 h 치료 (D) Simvastatin HepG2 세포에서 현저 하 게 증가 됩니다. 데이터는 mean±SEM. N = 6 웰 스/그룹. 데이터는 2 또는 3 독립적인 실험의 대표. p < 0.0001 양방향 ANOVA를 사용 하 여입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 . LDL의 통풍 관을 낮추는 에이전트, Dynasore에 의해 간세포 암 (HepG2) 세포에 LDL 유입 감소. 단계 개체 및 HepG2 세포에 대 한 빨간색 개체의 대표 이미지 0.33 h (왼쪽된 패널)에 묘사 되 고 4.33 h 끝점 (오른쪽 패널) 세포의 건강 상태를 표시. 40 µ M Dynasore, LDL-콜레스테롤 흡수를 줄이기 위해 알려진 긍정적인 제어 (C)으로 사용 되었다. 이미지는 10 배 확대에서 촬영 했다. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 6 . 인간의 신장 관 상피 (HK2) 세포에 LDL 통풍 관-저하 에이전트, Dynasore 및 rPCSK9에 의해 LDL 유입 감소. 단계 개체와 0.33 h (왼쪽된 패널)와 4.33 h 끝점 (오른쪽 패널)에 묘사 하는 HK2 세포에 대 한 빨간색 개체의 대표 이미지는 세포의 건강 상태를 표시 합니다. 40 µ M Dynasore (C), 또는 10 µ g/mL rPCSK9 (D), 긍정적인 통제로 알려진 LDL 콜레스테롤 흡수를 감소 시키는 사용 되었다. 10 배 확대에서 이미지를 가져옵니다. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 7 . LDL의 통풍 관을 낮추는 에이전트, Dynasore에 의해 인간의 관상 동맥 내 피 세포 (HCAECs)의 LDL 유입 감소. 단계 개체와 0.33 h (왼쪽된 패널)와 4.33 h 끝점 (오른쪽 패널)에서 묘사 된 HCAECs에 대 한 빨간색 개체의 대표 이미지는 세포의 건강 상태를 표시 합니다. 40 µ M Dynasore, LDL-콜레스테롤 흡수를 줄이기 위해 알려진 긍정적인 제어 (C)으로 사용 되었다. 이미지는 10 배 확대에서 촬영 했다. 눈금 막대 = 100 µ m. 데이터는 mean±SEM. N = 6 웰 스/그룹. 데이터는 2 또는 3 독립적인 실험의 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 표 1: 정의 매개 변수 처리. 이 매개 변수는이 프로토콜에 사용 되는 분석 시스템에 대 한 특정. 매개 변수 빨강 채널에 빨강 영역과 단계 채널에서 셀의 영역 분석을 설정 해야 합니다. 매개 변수 설정은 HepG2, HK2, HCAE 셀 라인 표시 됩니다. 표 2: HK2, HCAE, HepG2 세포의 LDL 유입 비율 변경 4.3 h. Dynasore, rPCSK9, 또는 Simvastatin 치료 (A) HepG2 세포, (B) HK2 셀, (C) HCAE 세포, 및 (D) HepG2 세포.

Discussion

현재 프로토콜을 다양 한 인간의 세포 라인에 시간 과정을 통해 실시간으로 LDL의 통풍 관을 측정 하기 위한 더 효과적인 방법으로 라이브 셀 이미징의 사용률이 보여 줍니다. 인간 간 암 (HepG2) 세포는 콜레스테롤을 낮추는 치료제21,22,23,,2425,26에 대 한 심사는 연구에 일반적으로 사용 되 39,40. 따라서, 우리 LDL 유입 연구에 대 한 라이브 세포 이미징 시스템의 능력을 테스트 하기 위해이 셀 형식을 선택 했다. 우리의 결과 HepG2 세포는이 새로운 기술 및 최종 끝점으로 4.33 h까지 유입 분석 결과의 기간에 대 한 지속적인 LDL의 통풍 관을 나타내는 같은 sigmoid 곡선에 결과 호환 나타냅니다 (그림 2A 와 그림 3 ).

콜레스테롤 항상성 다양 한 nephropathies의 이상에서 주요 역할을 한다. 실제로, 신장 조직에 콜레스테롤 축적 신장 섬유 증 만성 신장 질환을 선도 하는 주요 기여자 이며 다양 한 nephropathies28,29,,3031에 주요 병 리. 따라서, 우리는 신 장학 분야에서 인기 있고 신뢰할 수 있는 셀 라인으로 인간의 신장 상피 (HK2) 셀에 우리의 방법을 검사 합니다. 우리의 데이터는 또한 측정 HK2 세포에 LDL 유입 하 라이브 셀 이미징 시스템의 타당성을 지원. 그림 2B에서 같이, HK2 세포 유입 연구 (4 시간)의 기간에 걸쳐 선형으로 LDL 콜레스테롤을 했다.

개발 및 아 테 롬32,33,41, 차례로 전세계 한 살인자는 심혈 관 질환의 주요 원인의 진행에서 콜레스테롤 물질 대사의 중요성 때문 42, 우리는 아 테 롬 관련 셀 형식에서 우리의 방법의 유효성을 검사 목적. 우리 인간의 관상 동맥 내 피 세포 (HCAECs), 이들은 동맥 경화 환자의 관상 동맥 루멘에 콜레스테롤 모욕에 노출 되는 첫 번째 셀 유형 중 사용. 그림 2C 에 표시 된 데이터는이 LDL 유입도 방법은 효과적으로 HCAECs로 나타냅니다. 결과 그래프는 HepG2 세포의 모양의 sigmoid 곡선 이다.

유효성 및 심사 LDL-콜레스테롤 통풍 관에 영향을 미치는 화합물이 향상 된 LDL 유입 분석 결과의 감도 테스트 하려면 세 개의 컨트롤, LDL 통풍 관을 낮추는 대리인 Dynasore 및 rPCSK9, 및 LDL 유입 활성 제 Simvastatin 사용. 여기, 우리는 위의 치료 Dynasore 또는 유입 분석 결과 이전 rPCSK9의 최적화 된 농도와 세포 라인 (HepG2, HK2 및 HCAECs)를 언급 한. 우리의 결과 모든 3 개의 테스트 셀 라인 4 시간 과정 (그림 2) LDL 유입에 상당한 감소와 치료에 반응을 보였다. 예를 들어, 마지막 시간 지점으로 4.33 h, 40 µ M에 Dynasore 치료 크게 감소 53%, 68%, 54%로 LDL 유입 HepG2 세포, HK2 세포와 HCAECs 각각 (p < 0.0001; 그림 2 A-C 와 표 2A-C). 또한, 10 µ g/mL에서 rPCSK9 HK2 세포에 LDL 유입에 표시 된 55% 감소를 발생 (p < 0.0001; 그림 2 B 고 표 2B). 또한, 우리의 연구 결과 LDL 유입에 상당한 변경 감지를이 방법의 감도 지 원하는 LDL의 통풍 관 (그림 3)에 표시 된 증가 결과 HepG2 세포 Simvastatin으로 치료 했다. RPCSK9 HCAEC 및 HepG2 세포 치료 연구 rPCSK9 문서화 결과 추가 제어 치료로 사용 하지만 소량에서 구매 비용이 많이 드는이 프로토콜에 포함 되지 않습니다. 따라서 rPCSK9만 HK2 세포에서이 프로토콜을 확인 하기 위해 사용 되었다.

라이브 셀 이미징 분석 기능과 적시 측정의 LDL 유입, 건강 및 세포의 형태학의 지속적인 모니터링에 대 한 허용과 함께. 이 장점을 효율적으로 만드는이 방법은 약리 활동 및 세포 독성을 동시에 모니터링을 위한 이상적인 기술 적용 된 화합물의 잠재적인 세포 독성을 검색할 수 있습니다. 그림 5-7 net LDL 유입에 치료의 효과 대 한 시각적 참조로 최종 끝점 (4.33 h)에서 3 개의 테스트 셀 라인의 대표 이미지를 설명 하 고 건강 한 형태는 테스트에 따라 셀의 표시 치료입니다. 셀의 heathy 형태학 연구 기간에 대 한 보장을 각 우물에서 모든 이미지의 시각적 검사를 것이 좋습니다. 데이터 표시 되지, HepG2 세포의 이미지 80 μ M로 치료 하는 경우에 예를 들어 Dynasore 검사 했다, 접시를 해제, 세포 분리의 높은 농도 제안 하는 셀의 가장자리 등장으로 셀 분리의 관찰 Dynasore입니다. 또한, 또한 변경 된 형태를 나타내는 이끌어 simvastatin (3-10 μ M)의 높은 농도 높은 복용량 statins45의 대 한 보고 apoptosis를 유도 한다. 이 프로토콜은 20-80 μ M에 Dynasore 치료 및 0.5-10 μ M 농도에서 Simvastatin 셀 이미지 셀의 상태를 분석 하 고 확인에 치료의 잠재적인 ctotoxicity 사용 된 다음의 적정 수행 하는 데 사용 됩니다. 다양 한 농도 결과 최적의 농도 40 μ M의 사용에서 Dyansore와 1 μ M simvastatin에 대 한 제안.

마지막으로, 다른 셀 라인 일관 된 결과를 잘 당 최적의 휴대폰 번호를 확인 하기 위해이 방법으로 테스트 하는 경우 셀 밀도 적정 연구를 수행 하는 것이 좋습니다. 우리의 셀 밀도 최적화 연구 24-잘 접시에 셀/잘 10000 HK2 및 HCAE 세포에 대 한 일관 된 LDL 유입 결과 이어질 나타났다. 그것은 것이 LDL 유입 분석 결과 라이브 셀 이미징 시스템을 사용 하 여에 대 한 비 합칠 셀 우물에 균등 하 게 분산의 단층은 바람직한으로 세포의 덩어리는 최종 정규화 된 LDL 유입 값에 오류를 야기할 수 있습니다. 이 대 한 이유는 유입 데이터의 정규화에 대 한 위상 개체 영역 셀 밀도의 측정으로 사용 되 고이 매개 변수 수 있습니다 부정적인 영향을 수 때 형성 되는 세포 덩어리 이다. HepG2 세포 셀/잘 일으키는 일관성 유입 결과; 5000 보다는 더 높은 밀도에서 시드 때 폼 덩어리를 경향을 관찰 따라서, 우리가 5000 셀 24-잘 접시에 잘 당으로 사용 최적의 밀도 HepG2 세포에 대 한.

우리의 방법 약리학 활동과 동시에 LDL 유입 규제 하는 화합물의 세포 독성 검사에 대 한 중간-높은 처리량 플랫폼을 제공 합니다. 이 메서드는 입력 실시간에서 ligand 이해를 평가 하는 lysosomal 구획 다른 붙일 레이블 ligands와 함께 사용 하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 제공 하는 동안 InCucyte에 대 한 사양을 라이브 이미징 고 분석 시스템, 프로토콜 Cellomics 대체 이미징 시스템을 위한 적응 시킬 수 있다.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 라스를 다음 보조금에 의해 지원 되었다: 건강의 국립 연구소 (R56HL132209 및 1R01HL140468)와 마이애미 심장 연구소. 켄터키는 미국 심장 협회 Predoctoral 친교 (18PRE33960070)의 받는 사람입니다. HepG2 세포 박사 에마뉘엘 토마스, 마이애미 밀러의 대학 대학원 의학46,,4748친절 하 게 제공 되었다.

Materials

pHrodo Red-LDL ThermoFisher Scientific L34356
HepG2 cells E. Thomas Lab, U. Miami HB-8065
MEM Sigma M0325
Sodium Pyruvate Sigma P5280
L-Glutamine 200mM solution Sigma G7513
FBS Atlas Biologicals FP-0500-A
HK2 cells ATCC CRL-2190
Keratinocyte SFM media kit Gibco 17005-042
Primary Coronary Artery Endothelial Cells ATCC PCS-100-020
Vascular Cell Basal Medium ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF ATCC PCS-100-041
Human Lipoprotein Deficient Serum Millipore LP4
PBS Sigma D8537
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056
Trypsin-EDTA (0.05%) Gemini Bio-Products 400-150
Trypsin Neutralizing Solution ATCC PCS-999-004
24 well plate Falcon 353226
40 μM mesh cell strainer VWR 10199-654
15 mL conical tubes VWR 89039-666
50 mL conical tubes VWR 89039-658
Trypan Blue Staining (0.4%) Life Technologies T10282
Counting Slides Bio-Rad 145-0011
Incucyte Zoom Sartorius Zoom Imaging and analysis platform
Dynasore Hydrate Sigma D7693
PCSK9 Recombinant Protein Cayman Chemicals 20631
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Referencias

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Ritter, P., Yousefi, K., Ramirez, J., Dykxhoorn, D. M., Mendez, A. J., Shehadeh, L. A. LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring. J. Vis. Exp. (141), e58564, doi:10.3791/58564 (2018).
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