小角度 x 射线散射溶液中大分子的结构研究

本文协议部分概述的 saxs 数据分析的关键步骤包括缓冲减法、吉尼耶分析、克拉特基分析、数据合并和 p (r) 分布。从一开始的珠子建模太广泛了, 无法在这里详细介绍, 因此只简单介绍。

在同步加速器 (例如德国的 desy、英国的 diamond 和法国的 esrf), 可以收集每个样本的很小一部分 (~ 少量μl) 的 saxs 数据, 因为分数是从在线连接的 s 列中提取出来的 (参见图 1)。).弹性散射的 saxs 数据是径向平均使用仪器制造商提供的包或由同步加速器, 然后才可以进行缓冲减法。生成的一维数据表示 y 轴和散射角 (q = 4 sin , 其中是入射 x 射线的波长) 上的散射光量 (在 i(q) 中), 如图 1所示。该程序 PRIMUS/qt¹²用于直接减去任何背景由于缓冲区, 并在第1.1 节中描述。其他方案, 如;scotter⁴³ (下载可在www.bioisis.net), 教程可在 https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA 和生物 xtas raw⁴⁴ (可在http : ps:///bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) 可用作 atsas 软件包的替代方案。

guinier 分析提供了有关样品聚集和均匀性的信息, 并根据来自低区域¹⁴的 saxs 数据为感兴趣的大分子提供了陀螺半径 (r_g)。利用 PRIMUS/qt 构造了从每个浓度获得的 saxs 数据的图形, 然后是最大范围为 q x r g的最大范围为1.30的曲线拟合。单分散样品制备应在该区域提供线性吉尼耶图 (图 2d), 而聚合则产生非线性吉尼耶图^15,16。如果 guier 分析是线性的, 那么在决定是执行刚体建模还是构建低分辨率模型的合奏时, 克拉特基图可以观察到感兴趣的大分子的 “展开” 程度, 这很有用。球状蛋白质将出现在克拉特基地块上, 形成钟形曲线, 而扩展分子或展开的肽将出现在高原甚至在较大的q范围内增加, 并且缺乏钟形 (图 2c)。

从 guier 分析中获取_{r g} 只考虑一维散点图的低q区域的数据点 (图 2d), 但是, 可以使用几乎整个数据集执行间接傅立叶变换将 ln (i (q) ) vs . (q) 的往空信息转换为提供 d max 和 r g 信息的真实空间距离分布函数 (p (r) ) (图 2 b)p(r) 图的形状代表了^感兴趣的大分子的总溶液构象 18^,19。将往空数据转换为真实空间数据是一个关键的步骤, 但详细的描述不在本文的范围之内。因此, 请参考 svergun²⁰的文章来了解每个参数。

一旦通过具有一致 r g 值的 guier 分析处理单个浓度下的缓冲减去_数据, 然后使用 kratky 分析调查其折叠模式, 这些数据就可以合并。如上文所述, 对 nidogen-1、层压蛋白γ-1 及其复合物的合并数据进行了处理, 得到的 p (r) 图如图 2b所示。理想情况下, 还应计算每个浓度的对距分布函数 p (r), 以确定为每个浓度收集的 saxs 数据是否提供了类似的r_{g 和} d_最大值。如果r_g 和d_最大值在广泛的浓度范围内保持相似, 则用户应继续。需要注意的是, 根据信号的不同, 数据可能会在数据合并之前被截断。如果正在调查的大分子的浓度和分子量较低, 通常会出现这种情况。

使用 dammin 的低分辨率形状分析可以在各种模式下执行 (例如, 快速、慢、专家模式等)。快速模式是评估 p (r) 图是否提供了高质量模型的理想第一步。通常情况下, 每个 p (r) 图至少应获得10个模型, 以检查是否获得了低分辨率结构方面的可重现结果, 拟合参数的优度较低 (根据我们的大量工作, 0.5-1.0 的值被认为是好的), 该值描述实验收集的 saxs 数据和模型派生数据之间的协议。出于发布目的, 我们通常使用 “慢速” 或 “专家” 模式, 并计算至少15个模型。除了 dammin, 它的一个更快的版本, dammif³⁷, 以及 gasbor 38 也是替代品^.此外, 为了研究蛋白质蛋白或蛋白质核酸复合物, 可以使用 monsa 程序³⁵, 这有助于同时拟合单个 soxs 数据的两个大分子以及它们的复合体。有关高分辨率模型计算以及 rna-蛋白质相互作用研究的更多细节, 请参阅 patel等人3的最新文章。

saxs 理论上很简单, 但无疑是对其他结构生物学工具高度互补的方法, 其结果是低分辨率的结构数据, 可以单独使用, 也可以与高分辨率技术结合使用, 以阐明信息关于大分子结构和动力学只要能得到大分子及其配合物的单分散制剂, 就可以利用 saxs 研究任何类型生物大分子的溶液内结构和相互作用。在这里讨论的复合体的情况下, 值得注意的是, 只有不到10% 的氮-1 和层压蛋白γ-1 的整体可访问表面积被埋在这个复合体中, 而这两种蛋白质的其余领域都可以自由地与其他蛋白质相互作用。细胞外基质处的蛋白质, 以保持其结构刚性 (图 3)。使用其他结构生物学技术, 如 x 射线晶体学、核磁共振和低温显微镜, 获得具有 ~ 240kDa 的复杂物的此类信息将是非常具有挑战性的。

通过 x 射线晶体学或核磁共振发现蛋白质结构是一个固有的耗时过程。结构确定中的这一瓶颈是 saxs 作为结构技术的强度所在的一个领域;单个 saxs 实验的数据采集可能需要不到一个小时的时间, 借助简化的分析软件, 可以快速高效地进行分析。saxs 作为一种独立技术, 有可能大大提高结构研究的吞吐量, 因为它在获得高分辨率数据之前提供了一个低分辨率的大分子结构模型。其他结构技术的一个障碍是需要一个高度纯净、集中的样本来获取数据, 这就需要在很长一段时间内获得高水平的蛋白质表达和稳定性。虽然 saxs 样品也需要是纯和浓缩的, 但样品量大约为 100μl, 使 saxs 与其他结构技术相比是一种相对便宜的分析方法。此外, saxs 与尺寸排除色谱相结合, 变得越来越普遍, 这提供了一个额外的质量控制步骤。最近, 使用集成优化方法 (eom)⁴⁵、⁴⁶来阐明柔性系统的核磁共振和 saxs 数据的组合有了很大的进展。在 mertens 和 svergun⁴⁷最近的一篇论文中, 作者描述了最近 eom saxs 与核磁共振的多个例子, 以及与 nmr 结合使用的许多其他 saxs 数据的例子。在 saxs 领域不断取得进展, 并正在开发新的技术, 以便将 saxs 与其他结构技术结合使用, 而不仅仅是对其他结构技术的补充。因此, 我们认为, 随着时间的推移, 对 saxs 的需求只会增加, 特别是与 nmr 一起描述由灵活性定义的动态系统。