Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro

Monocyten een fagocytische onderdeel vormen van aangeboren immuniteit dat essentieel is voor de bestrijding van ziekteverwekkers, opruimen van beschadigde weefsels, angiogenese en de pathofysiologie van vele ziekten, waaronder kanker^1,2,3 . Monocyten zijn beenmerg-afgeleide cellen samengesteld van heterogene subpopulaties die circuleren in het bloed, maar op de site van ontsteking in perifeer weefsel kunnen worden aangeworven door middel van specifieke moleculaire mechanismen. De aanwerving cascades van monocyten, wat betreft de leukocyten in het algemeen impliceert verschillende stappen waaronder vangen, rollen, kruipen, arrestatie, migratie van signaalcomplexen (zielsverhuizing) en migratie door de vaatwand (kelder membraan en muurschildering cellen)⁴. Deze maatregelen betreffen voornamelijk ontsteking geïnduceerde moleculen op het endotheel luminal oppervlak zoals selectinen, glycoproteïne liganden chemokines, intercellulaire en regulates celadhesie-moleculen en hun receptoren op leukocyten zoals selectine liganden en integrins. Mensenhandel trajecten via ofwel de endothelial cel kruispunten (paracellular) of via de endothelial cel lichaam (transcellulair) kunnen worden gebruikt door leukocyten te steken van het endotheel barrière-⁵. Terwijl monocyten zijn historisch gedocumenteerd te transmigrate door de transcellulair-route, hebben mogelijke verschillen in hun trekkende traject voorgesteld als monocyten zijn niet langer beschouwd als een homogene-celpopulatie. Het is nu duidelijk dat monocyt diversiteit kan worden gedefinieerd door elk van hun verschillen en overeenkomsten, met betrekking tot hun kenmerkende extravasation cascades^3,6. Daarom, teneinde ondubbelzinnig onderscheid te maken tussen monocyt subpopulaties, is het van cruciaal belang om te visualiseren en fenotype het gedrag van elk van deze verschillende subpopulaties tijdens de aanwerving verwerken.

Monocyten van menselijke, pig, rat en muis waren onderverdeeld in fenotypische subpopulaties met bepaalde waaraan functies en specifieke trekkende gedrag^7,8,9. Bijvoorbeeld, bij de mens, kunnen monocyten worden onderverdeeld in drie subgroepen op basis van hun oppervlakte uitdrukking van CD14, een co-receptor voor bacteriële lipopolysaccharide en CD16, de Fc-gamma receptor III. Menselijke monocyt subpopulaties omvatten klassieke CD14⁺CD16^–, middenniveau CD14⁺CD16⁺ en niet-klassieke CD14^dimCD16^{+ 6,9}cellen. De klassieke CD14⁺CD16^– monocyten bleken te zijn voornamelijk inflammatoire overwegende dat de pool van CD16⁺ monocyten bleken collectief te presenteren TIE2 meningsuiting en proangiogenic functie¹⁰. Consequent, endothelial cel stimulatie met inflammatoire cytokines zoals menselijke tumor necrose factor (TNF) α of Interleukine (IL-1) beta (conventionele ontsteking) is voldoende om te leiden tot de volledige aanwerving van klassieke CD14⁺CD16 ^– de monocyten. Gelijktijdige acties van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) A en TNFα (angiogenic factoren gestuurde ontsteking) zijn echter vereist om te provoceren de transmigratie van de CD16⁺ proangiogenic pool van monocyten³. In het verleden het traditionele systeem van de Transwell onder statische omstandigheden, de parallelle plaat stroom zaal en de µ-dia stroom kamers zijn gebruikt om het kwantitatief analyseren de aanwerving van een leukocyte bevolking op een tijd in vitro^{11 ,12,13}. Terwijl deze protocollen zijn gevalideerd, een meer robuuste methode waardoor de gelijktijdige analyse van meerdere monocyt subpopulaties zou worden beschouwd als meer inzicht. Dergelijke methodologieën moeten rekening voor meerdere interacties en de verschillende frequenties van elke respectieve bevolking en bieden ook een mechanistische inzicht in de gelijkenissen en de specifieke kenmerken voor de aanwerving cascades die elke monocyt bepalen subset.

Hier presenteren we een methode gebaseerd op de time-lapse beeldvorming van monocyt recruitment onder stroom waarmee de trekkende cascades van verschillende monocyt subpopulaties gelijktijdig worden bestudeerd met behulp van de confocal microscopie. Deze methode integreert bepaalde kritische features die endothelial cel ontsteking, evenals de hemodynamica van circulerende monocyten in post capillaire venules, de hoofdlocatie van leukocyten aanwerving in vivo na te bootsen. De voorgestelde methode maakt gebruik van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC), die worden gegenereerd door een goed gangbaar protocol van isolatie van menselijke umbilical koorden. Deze klinische resource heeft het voordeel dat ze gemakkelijk beschikbaar als biologische bijproduct, terwijl ook het verstrekken van een redelijk rendement van endotheliale cellen die geïsoleerd uit de navelstreng ader worden kunnen. Wij ook gebruikt fluorescente kleurstoffen en immunofluorescentie onderscheid maken tussen de verschillende cellulaire componenten, en confocale microscopie ondubbelzinnig definiëren monocyt positionering (luminal vs. abluminal) na verloop van tijd. Het hier gepresenteerde protocol heeft ontwikkeld om tegelijkertijd maatregel de zielsverhuizing niveaus van monocyt subpopulaties. Bovendien moet worden opgemerkt dat deze methode kan worden uitgebreid om te bestuderen van andere leukocyten subpopulaties en recruitment processen door gebruik van verschillende biomerkers en etikettering.