Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma
Summary
Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.
Abstract
Hedeflenen periferik dokulara kan üzerinden monosit alımı, doku hasarı, tümör gelişimi ve otoimmün hastalıklar sırasında enflamatuar süreç önemlidir. Bu onların yapışma ve transendothelial göç (hicret) temel etkilenen doku takip aktive endotel hücrelerinin luminal yüzeyine serbest akışı yakalama sürecinde kolaylaştırılmıştır. Ancak, monosit altgrupları Tercihli ve içerik bağımlı alımı destek mekanizmaları hala tam anlaşılır. Bu nedenle, aynı anda görüntülenir ve akış altında ölçülen için farklı monosit altgrupları alımı sağlayan bir yöntem geliştirdik. Hızlandırılmış confocal görüntüleme üzerinde dayalı bu yöntemi yapışık ve transmigrated monosit arasında kesin ayrım olanak sağlar. Burada, bu yöntem aynı anda pro-anjiogenik ve sigara anjiogenik monosit tüp bebek işe alım çağlayan eğitim için nasıl kullanılabileceği açıklanmaktadır. Ayrıca, bu yöntem en çok üç monosit nüfus alımı farklı adımları incelemek için uzun olabilir.
Introduction
Hasarlı doku, anjiogenez ve kanser1,2,3 de dahil olmak üzere birçok hastalığın patofizyolojisi temizlik patojenler, kavga ettiği için esastır doğuştan gelen bağışıklık fagositik bileşeni monosit teşkil . Monosit, kanda dolaşan, ancak periferik doku iltihabı site için belirli moleküler mekanizmalar aracılığıyla işe heterojen altgrupları oluşur ve kemik iliği türevi hücrelerdir. Monosit, lökosit gelince işe alım cascades genel olarak, yakalama, inişli çıkışlı, tarama, tutuklama, transendothelial geçiş (hicret) ve geçiş damar duvarı (membran ve duvar resmi de dahil olmak üzere farklı adımları implicates hücreleri)4. Bu adımlar, esas olarak iltihap kaynaklı moleküller üzerinde endotel luminal yüzeyinde selectins, glikoprotein ligandlar, kemokinler, hücreler arası ve bileske adezyon molekülleri ve onların reseptörleri gibi ligandlar selektin gibi lökosit içerir ve integrinler. Ticaret yolları endotel hücre kavşak (paracellular) veya endotel hücre vücut (transcellular) aracılığıyla endotel bariyer5geçmeye lökositler tarafından kullanılabilir. Monosit tarihsel transcellular yönlendirme yolu transmigrate için dokümante edilmiş iken, monosit artık homojen hücre nüfus kabul edilir gibi onların göç yolu içinde olası farklılıkları gidermek önerilmiştir. Şimdi monosit çeşitlilik her onların farklılıklar ve ortak tarafından tanımlanabilir,3,6ile ilgili olarak kendi kendine özgü ekstravazasyonu basamaklandırır açık hale geliyor. Bu nedenle, belirsizliğe yer bırakmadan monosit altgrupları arasında ayırımcılık için görselleştirmek önemlidir ve fenotip her işe alım sırasında farklı bu altgrupları davranışını işlemek.
Monosit gelen insan, domuz, fare ve fare ile belirli görev atfedilen ve özel göçmen davranış7,8,9fenotipik altgrupları içine kentler. Örneğin, insanlarda, monosit CD14, bakteriyel lipopolysaccharide için bir coreceptor ve CD16, Fc-gama reseptör III onların yüzey ifadeye dayalı üç alt kümeleri ayrılabilir. İnsan monosit altgrupları dahil klasik CD14+CD16–, orta CD14+CD16+ ve klasik olmayan CD14dimCD16+ hücreleri6,9. Klasik CD14+CD16– monosit esas olarak iltihaplı olmak gösterildi ise CD16 havuzu+ monosit topluca TIE2 ifade ve proangiogenic işlev10sunmak için bulunmuştur. Sürekli olarak, endotel hücre stimülasyon ile inflamatuar sitokinlerin gibi insan tümör nekroz faktör (TNF) α veya interlökin (IL-1) beta (geleneksel iltihabı) klasik CD14 tam istihdamı tetiklemek yeterli+CD16 – monosit. Ancak, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) A ve TNFα (anjiogenik faktörler tahrik iltihabı) eş zamanlı eylemleri CD16 hicret kışkırtmak için gerekli olan+ proangiogenic havuzu monosit3. Tarihsel olarak, statik koşulları, paralel plaka akışı odası ve μ-slayt akışı odaları geleneksel Transwell sisteminde kullanılan kantitatif analiz bir lökosit nüfus bir zaman vitro11, işe alım ,12,13. Bu protokoller doğrulandıktan iken, aynı anda birden fazla monosit altgrupları analizine izin daha sağlam bir yöntem daha anlayışlı olarak değerlendirilir. Böyle metodolojisi birden çok etkileşimler ve her ilgili nüfus farklı frekansları için hesap ve ayrıca her monosit tanımlamak işe alım cascades için benzerlikler ve özelliklerine mekanik bir anlayış sağlamak alt küme küme.
Burada, aynı anda confocal mikroskobu kullanılarak belirlenmesi için farklı monosit altgrupları göçmen cascades sağlayan akış altında monosit alımı zaman hata görüntüleme dayalı bir yöntem mevcut. Bu yöntem endotel hücre iltihabı, hem de sonrası kapiller venüller, monosit dolaşan hemodinami lökosit işe alım içinde vivo ana konumunu taklit bazı kritik özellikleri entegre. İnsan göbek bağları izolasyonu iyi kurulmuş bir protokol aracılığıyla oluşturulan insan göbek damar endotel hücreleri (HUVEC), önerilen yöntem kullanır. Bu klinik kaynağın ederken aynı zamanda umbilikal ven ayrılmış olabilir endotel hücrelerinin makul bir verim sağlayan biyolojik bir yan ürün kolayca kullanılabilir olmanın avantajı var. Biz de floresan boyalar ve ayirt farklı hücresel bileşenleri ve belirsizliğe yer bırakmadan monosit (abluminal vs. luminal) konumlandırma tanımlamak için confocal mikroskobu arasında ayırt etmek için kullanılan zaman içinde. Burada sunulan Protokolü monosit altgrupları hicret düzeyde aynı anda ölçmek için geliştirilmiştir. Ayrıca, bu yöntem diğer lökositler altgrupları ve işe alım süreçleri çalışmaya farklı biyolojik ve etiketleme kullanımı ile uzatılabilir olduğunu belirtmek gerekir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, bir yöntemi nasıl monosit altgrupları iltihaplı endotel monolayer transmigrate bir çalışma ayrıntılı raporu. Confocal mikroskobu Ayrıca monosit işe akışı3,11,19altında incelemek için kullanılır faz kontrast mikroskobu yerine kullanılan çok tartışılan yöntem. Confocal Mikroskopi için hızlandırılmış Imaging’i kullanma bir büyük avantajı belirsizliğe yer bırakmadan hicret ve güçlü yap?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Paul Bradfield okuma el yazması ve geri bildirimler için teşekkür ederiz. A. S., efendim Jules Thorn hayırsever yurtdışı güven trafiğe çıkış mali destek aldı.
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
Referencias
- Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
- De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
- Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
- Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
- Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
- Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
- Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
- ibidi GmbH. . Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides – Based on Numerical Calculations. , (2014).
- Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).
- Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).
