发展中雏鸡光学顶盖中切向细胞迁移的可视化
Summary
我们描述了通过电穿孔荧光标记切向迁移细胞的方法, 以及在扁平支架培养中标记细胞运动的延时成像, 以可视化发展中的小鸡光学顶盖的迁移细胞行为。.
Abstract
延时成像是分析迁移细胞行为的有力方法。荧光细胞标记后, 可在影像显微镜下记录培养中标记细胞的运动。为了分析发育中大脑中的细胞迁移, 切片培养通常用于观察与切片部分平行的细胞迁移, 如径向细胞迁移。但是, 可以从切片区域性方法获得有限信息, 以分析垂直于切片部分的单元迁移, 如切线单元迁移。在这里, 我们提出了延时成像的协议, 用于可视化发展中的小鸡光学顶盖中的切向细胞迁移。通过电穿孔蛋细胞标记的组合以及细胞培养插入物上的随后的扁平安装培养, 可以检测水平平面中的迁移细胞运动。此外, 我们的方法有助于检测单个细胞的行为和一组细胞在长期的集体行动。该方法可用于检测荧光标记微结构的序列变化, 包括非神经组织中神经组织或细胞移位的轴突伸长。
Introduction
随着实时成像技术的进步, 细胞迁移研究也在不断发展。荧光细胞标记后, 在培养皿或体内标记细胞的时间运动可以记录在视频显微镜下。在神经发育研究中, 采用时移成像技术分析了移植细胞或伸长轴突的形态学变化。为了有效的成像, 在实验和分析的目的基础上, 应用合适的荧光细胞标记和组织制备方法是非常必要的。为了分析发育中大脑中的细胞迁移, 切片培养通常用于观察与切片部分平行的细胞迁移, 如径向细胞迁移1、2、3。切片培养系统也用于检测切向细胞迁移4,5, 但它不适合定向分析的情况下, 细胞分散垂直于切片部分。
光学顶盖由在胚胎发育过程中由径向和切向细胞迁移形成的多层结构组成。顶盖层的形成主要依赖于心室区分裂后神经元前体细胞的径向迁移, 其最终终点与心室区6的出生日期相关。对于切向迁移, 我们以前报告了发展中的小鸡光学顶盖中和表层的两个迁移流。在 E6-E8 期间的中层层中, 具有长前导过程和薄尾随过程的双极性细胞迁移背或腹侧沿顶盖传出轴突束运行手背-腹侧7。在 axophilic 迁移后, 细胞分化为位于深层的多极神经元。在 E7-E14 的表层层中, 迁移细胞通过重整分枝前导过程并分散到多个方向8, 水平离散。在分散迁移后, 后体细胞最终分化为各种形态的表面神经元。在这两种情况下, 平板式培养都能有效观察与软脑膜表面平行的细胞运动。
在这里, 我们提出了一个延时成像协议, 用于可视化发展中的小鸡光学顶盖7,8中的切向细胞迁移。在蛋中通过电穿孔将细胞标记结合在一起, 然后在细胞培养插入物上进行扁平安装培养, 可以检测迁移的细胞移动和迁移方向。该方法的目的是促进检测在长期的单个细胞行为和一组细胞在水平平面的集体行动。
Protocol
Representative Results
Discussion
上述协议针对浅层6、8中的细胞迁移进行了优化。它适用于检测中间层迁移流 (电影 5)6,7, 只是通过改变电穿孔的时间 (E5.5 到 E4.5) 和文化和成像的起始 (E7.0 到 E6.0)。
所提出的程序由蛋、扁平安装培养和时移共聚焦成像 (图 1)中的电穿?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
此工作由 jsp KAKENHI 授予编号15K06740 支持 Y.W。
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
Referencias
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Biología del desarrollo. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
