Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para identificar os eventos de recombinação homóloga que ocorreram em células-tronco embrionárias do mouse usando a mancha do Sul e/ou PCR. Este método é exemplificado pela geração de nonmuscle myosin II substituição genética rato modelos usando embrionária baseada em células-tronco homóloga mediada por recombinação segmentação tecnologia tradicional.
Abstract
Relativo a questões dos efeitos fora do alvo e a dificuldade de inserção de um fragmento de DNA a longa na aplicação do desenhador nucleases para tronco embrionárias, edição de genoma tecnologia de gene-alvo baseada em célula (ES) não tem estas deficiências e é amplamente usado para modificar o genoma do animal/rato que vão desde grandes exclusões/inserções para substituições de nucleotídeo único. Notavelmente, identificar os relativamente poucos eventos de recombinação homóloga (HR) necessários para obter desejado ES clones é um passo fundamental, que exige métodos precisos e confiáveis. Mancha do Sul e/ou PCR convencional é frequentemente utilizado para esta finalidade. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados de usar esses dois métodos para identificar o HR eventos que ocorreram em pilhas do ES do rato em que o gene Myh9 endógeno destina-se a ser interrompido e substituído por cDNAs codificação outras cadeias pesadas de miosina nonmuscle do IIs (IIs NMHC). Todo o processo de mancha do Sul inclui a construção de direcionamento vector(s), eletroporação, seleção de drogas, a expansão e armazenamento de células de ES/clones, a preparação, digestão e mancha de DNA genômico (gDNA), a hibridização e lavagem de ição e uma etapa final de autoradiografia sobre os filmes de raio-x. PCR pode ser realizado diretamente com gDNA preparado e diluído. Para obter resultados ideais, as sondas e a enzima de restrição (RE) sites de corte para a mancha do Sul e os primers para PCR devem ser cuidadosamente planejadas. Embora a execução de mancha do Sul é demorada e trabalhosa e resultados PCR tem falsos positivos, a correta identificação pela mancha do Sul e a triagem rápida pelo PCR permite que o aplicativo único ou combinado desses métodos descritos Neste trabalho a ser amplamente utilizado e consultado pela maioria dos laboratórios na identificação de genótipos de pilhas do ES e geneticamente modificado animais.
Introduction
A tecnologia do gene definião HR em pilhas do ES murino fornece uma ferramenta poderosa para dissecando as celulares consequências de mutações genéticas específicas1,2. A importância e o significado desta tecnologia são refletidas no seu reconhecimento por 2007 Prêmio Nobel de Fisiologia ou medicina de3,4; Enquanto isso, ele representa o advento da era moderna da engenharia do gene5. Gene-alvo através de HR pode ser utilizado para engenheiro praticamente qualquer alteração desde mutações pontuais até grandes rearranjos cromossômicos no genoma do rato ES células6,7. É sabido que, antes do surgimento das ferramentas de edição chamada genoma, a geração de um rato de nocaute do gene necessário a aplicação da tecnologia de gene-alvo no ES células8,9,10. Durante as últimas duas décadas, mais de 5.000 ratos gene-alvo foram produzidos por esta abordagem para a modelagem de doenças humanas ou estudar o gene funções11. Estabeleceu-se um esforço de todo o genoma nocaute para a distribuição de vetores do gene-alvo, alvo clones de células ES e ratos ao vivo para a comunidade científica2,12,13,14 , 15. sem dúvida, ES baseada em célula mediada por HR gene-alvo tecnologia avançou grandemente nossa compreensão das funções dos genes, jogados num contexto fisiológico ou patológico.
Porque o HR é um evento relativamente pouco frequente em mamíferos células16,17, o importante e o próximo passo a seguir direcionamento de gene em células de ES murino é analisar inúmeras colônias de ES para identificar alguns clones com mutações resultantes HR com o direcionamento de vetor18. Os métodos de ouro para a identificação de eventos HR incluem mancha do Sul e PCR19,20. As vantagens das abordagens incluem que mancha do Sul pode identificar corretamente direcionados ES clones e permite que os pesquisadores analisar a estrutura do evento gene-alvo, tais como a verificação de uma inserção de cópia única de construção, enquanto um Estratégia baseado em PCR permite mais rápida triagem para HR eventos21,22. Embora esses métodos têm desvantagens, tais como que eles são demorados e podem ter falsos positivos, o uso combinacional deles é amplamente aceites e aplicados pela maioria dos laboratórios em identificar eventos HR, particular em pilhas do ES, para gerar geneticamente modificado animais.
Três isoformas de miosina nonmuscle II (NM II) nos mamíferos, cada um composto por dois IIs NMHC idênticos que são codificadas por genes diferentes três (nomeado Myh9, Myh10 e Myh14) e dois pares de cadeias leves, são referidas como NM II-A, II-B e II-C23. Estudos anteriores indicaram que pelo menos as isoformas de NM II-A e II-B são essenciais para o desenvolvimento do mouse porque a ablação na vivo dessas isoformas resulta em embrionárias letalidade24,25,26. Para contornar este problema e obter novos insights sobre as funções específicas do isoform de NM II-A e II-B em fases posteriores do desenvolvimento do mouse, uma substituição genética foi adoptada a estratégia usando ES baseada em célula mediada por HR gene-alvo tecnologia para gere uma série de modelos de rato27. No curso de identificação de clones ES desejados, mancha do Sul e métodos PCR foram utilizados, e estas provaram para ser eficiente e confiável27,28.
Este trabalho pretende fornecer uma descrição detalhada do Sul da mancha e PCR, incluindo o projeto de segmentação vector(s) ição e as primeiras demão e a execução de experiências, bem como a análise dos resultados, exemplificado através da identificação de evento HR ocorrência em pilhas do ES para a criação do mouse NM II de substituição genética de modelos e dados representativos. Os protocolos destes dois métodos aqui apresentados também podem ser adoptados para identificar os genótipos de células geneticamente modificadas ou de animais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Atualmente, desenhador nucleases para genoma edição ainda não podem substituir tecnologia gene-alvo baseada em célula ES devido a seus problemas de efeitos fora do alvo e a dificuldade em inserir uma longa DNA fragmento30,31. Como os métodos de ouro para a identificação de HR eventos que ocorreram em pilhas do rato ES, este relatório fornece um protocolo detalhado da mancha do Sul e PCR para o campo. Nós validado a confiabilidade desses métodos, analisa…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho recebeu o apoio do programa geral da Fundação Nacional de ciências naturais da China (subvenções no. 31571432), humano Fundação Provincial de ciências naturais da China (Grant No. 2015JC3097) e a pesquisa Fundação de educação Bureau de Hunan Província, China (Grant No. 15 K 054).
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
Referencias
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