Identification des événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de transfert de Southern et la réaction en chaîne par polymérase
Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé pour identifier les événements de recombinaison homologue qui s’est produite dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de Southern et/ou PCR. Cette méthode est illustrée par la génération de modèles murins non musculaires myosine II remplacement génétique à l’aide traditionnelle embryonnaire sur les cellules souches homologue induite par la recombinaison technologie de ciblage.
Abstract
Relative aux éditions d’effets hors cible et la difficulté d’insérer un long fragment d’ADN dans l’application des nucléases concepteur pour tige de montage, embryonnaires génome technologie de ciblage de gènes cellulaires (ES) n’a pas ces défauts et est largement permet de modifier le génome de l’animal/souris allant des importantes destructions/insertions aux substitutions nucléotidiques. Notamment, identifier les événements de recombinaison homologue (HR) relativement peu nécessaires à l’obtention désiré clones d’ES est une étape clé, qui exige des méthodes exactes et fiables. Transfert de Southern et/ou PCR classique est souvent utilisé à cet effet. Nous décrivons ici les modalités d’utilisation de ces deux méthodes pour identifier des événements RH qui s’est produite dans les cellules ES de souris dont le gène Myh9 endogène est destiné à être perturbé et remplacé par ADNc codant les autre chaîne lourde de myosine non musculaire IIs (IIs NMHC). L’ensemble de la procédure de transfert de Southern comprend la construction de ciblage vecteur (s), électroporation, sélection de médicaments, l’expansion et le stockage de cellules d’ES/clones, la préparation, la digestion et transfert de l’ADN génomique (ADNg), l’hybridation et lavage des sondes et une étape finale d’autoradiographie sur les films radiographiques. PCR peut être effectuée directement avec ADNg préparé et dilué. Pour un résultat idéal, les sondes et les enzymes de restriction (RE) sites de coupe pour le transfert de Southern et les amorces pour la PCR doivent être soigneusement planifiées. Si l’exécution du transfert de Southern est longues et fastidieuses et PCR résultats faux positifs, l’identification correcte de Southern et le dépistage rapide par PCR permettent l’application seule ou combinée de ces méthodes décrites dans cet article d’être largement utilisé et consulté par la plupart des laboratoires dans la détermination des génotypes des cellules ES et génétiquement modifiés animaux.
Introduction
La technologie de ciblage par HR dans des cellules ES génique fournit un outil puissant pour disséquer les conséquences cellulaires des mutations génétiques spécifiques1,2. L’importance et la signification de cette technologie sont reflètent dans sa reconnaissance par le 2007 Prix Nobel de physiologie ou médecine3,4; pendant ce temps, il représente l’avènement de l’ère moderne du génie génétique5. Ciblage par HR génique peut être utilisé pour pratiquement n’importe quelle modification allant des mutations ponctuelles aux grandes réarrangements chromosomiques dans le génome de souris ES cellules6,7de l’ingénieur. Il est bien connu que, avant l’émergence des outils de montage de ce que l’on appelle génome, la génération d’un gène de souris knock-out a nécessité l’application de la technologie de ciblage de gène dans ES cellules8,9,10. Durant les deux dernières décennies, plus de 5 000 souris gène-cible ont été produites par cette approche pour la modélisation des maladies humaines ou en étudiant les gènes fonctions11. Un effort de Génome-large knockout a été établi pour la distribution des vecteurs de ciblage de gènes ciblés clones de cellules d’ES et souris vivantes à la communauté scientifique2,12,13,14 , 15. sans aucun doute, ES cellulaire induite par le HR-ciblage de gènes technologie a grandement contribué à améliorer notre compréhension des fonctions des gènes a joué dans un contexte physiologique ou pathologique.
Parce que h est un événement relativement rare en mammifères cellules16,17, l’important et l’étape suivante après ciblage de gènes dans des cellules d’ES est d’analyser les nombreuses colonies ES pour identifier quelques clones présentant des mutations résultant de HR avec le ciblage vecteur18. Les méthodes or pour identifier les événements HR comprennent le transfert de Southern et PCR19,20. Les avantages des approches comprennent que Southern peut identifier correctement ciblées ES clones et permet aux chercheurs d’analyser la structure de l’épreuve de gène-cible, comme une vérification d’une insertion de copie unique de la construction, alors qu’un Stratégie axée sur la PCR permet un dépistage plus rapid pour HR événements21,22. Bien que ces méthodes ont des inconvénients, tels que qu’ils prennent du temps et peuvent avoir faux positifs, l’utilisation de combinatoire d’eux est largement acceptés et appliqué par la plupart des laboratoires à identifier les événements RH, notamment dans les cellules ES, pour générer des organismes génétiquement modifiés animaux.
Trois isoformes de myosine non musculaire II (NM II) chez les mammifères, composées chacune de deux IIs de HCNM identiques qui sont codés par trois gènes différents (nommée Myh9, Myh10 et Myh14) et deux paires de chaînes légères, sont dénommés NM II-A, II B et II-C23. Des études antérieures ont indiqué qu’au moins les isoformes de NM II-A et II B sont essentiels pour le développement de la souris car l’ablation in vivo de ces isoformes se traduit par une létalité embryonnaire24,25,26. Pour contourner ce problème et obtenir de nouvelles idées dans les fonctions de l’isoforme spécifique de NM II-A et II B dans les derniers stades de développement chez la souris, un remplacement génétique stratégie technologie ES basés sur les cellules induite par le HR-ciblage de gènes a été adoptée à générer une série de souris modèles27. Au cours de l’identifiant les clones d’ES désirés, transfert de Southern et de méthodes PCR ont été utilisés, et ceux-ci s’est avérée efficace et fiable27,28.
Cet article a l’intention de fournir une description détaillée du sud de buvard et PCR, y compris la conception du ciblage vecteur (s), sondes et d’apprêts et l’exécution d’expériences, ainsi que l’analyse des résultats illustrée en identifiant événement RH présence dans les cellules ES pour la création de souris NM II remplacement génétique modèles et données représentatives. Les protocoles de ces deux méthodes présentées ici peuvent aussi être prises pour identifier le génotype des cellules génétiquement modifiées ou des animaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Actuellement, nucléases concepteur pour l’édition de génome toujours ne peut pas remplacer ES basés sur les cellules-ciblage de gènes technologie en raison de ses problèmes d’effets hors cible et la difficulté en insérant un long DNA fragment30,31. Comme les méthodes or pour identifier les événements RH qui s’est produite dans les cellules de souris ES, ce rapport fournit un protocole détaillé de Southern et PCR pour le champ. Nous avons valid?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail ont bénéficié du programme général de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions no 31571432), l’humain Provincial Fondation sciences naturelles de Chine (Grant No. 2015JC3097) et la recherche Fondation d’éducation Bureau du Hunan Province, Chine (subvention no 15 K 054).
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
Referencias
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
- Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
- Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
- Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
- Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
- Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
- Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
- Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
- Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
- Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
- Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
- Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
- Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
- Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
- Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
- Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
- Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
- Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
- Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
- Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
- Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
- Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
- Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).
