Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K
Summary
Espectroscopia de resonancia paramagnética (EPR) del electrón es un método inequívoco para medir a los radicales libres. El uso de puntas de prueba de giro selectivo permite la detección de radicales libres en diferentes compartimentos celulares. Se presenta un método práctico y eficiente para recolectar muestras biológicas que facilitan el tratamiento, almacenamiento y transferencia de muestras para mediciones de EPR.
Abstract
La detección precisa y específica de especies reactivas del oxígeno (ROS) en diferentes compartimentos celulares y tejido es esencial para el estudio de la regulación de redox señalización en configuración biológica. Espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR) es el método directo sólo para evaluar inequívocamente los radicales libres. Su ventaja es que detecta los niveles fisiológicos de especies específicas con una alta especificidad, pero que requiere de tecnología especializada, preparación de la muestra cuidado y controles adecuados para asegurar la correcta interpretación de los datos. Sondas de vuelta cíclica hidroxilamina reaccionan selectivamente con superóxido u otros radicales para generar una señal de nitróxido que puede cuantificarse por espectroscopia de EPR. Permeable a la célula spin sondas y puntas de prueba de giro diseñados para acumular rápidamente en la mitocondria permiten la determinación de la concentración de superóxido en diferentes compartimentos celulares.
En cultivos de células, el uso de 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine permeable de la célula (CMH) a lo largo de con y sin pretratamiento de células impermeables de la superóxido dismutasa (SOD) o uso de PEG-SOD permeable a la célula, permite el diferenciación de extracelular de citosólica superóxido. La 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitocondrial] piperidinium dicloruro (mito-TEMPO-H) permite la medición de ROS mitocondriales (predominante superóxido).
Puntas de prueba de giro y espectroscopia del EPR pueden aplicarse también a los modelos en vivo . Superóxido puede detectarse en los fluidos extracelulares como la sangre y el líquido alveolar, así como los tejidos como el tejido pulmonar. Se presentan varios métodos para procesar y almacenar el tejido para las mediciones del APE y entregar 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine intravenosa (CPH) spin sonda en vivo. Mientras que las mediciones pueden realizarse a temperatura ambiente, muestras obtenidas de modelos in vitro e in vivo también pueden ser almacenadas a-80 ° C y analizadas por EPR en 77 K. Las muestras pueden almacenarse en el establo de tubería especializada a-80 ° C y corren de 77 K para permitir un práctico, eficiente y el método reproducible que facilita el almacenamiento y transferencia de muestras.
Introduction
Mientras que las medidas de estrés oxidativo y especies reactivas del oxígeno son importantes para el estudio de diversas enfermedades a través de todos los sistemas del órgano, la detección de especies de oxígeno reactivo (ROS) es un reto debido a la corta vida media y alta reactividad. Una técnica de resonancia paramagnética (EPR) del electrón es el método más claro para la detección de radicales libres. Puntas de prueba de giro tienen ventajas sobre las sondas fluorescentes más comúnmente utilizadas. Aunque sondas fluorescentes son relativamente baratas y fáciles de usar y proporcionar una detección rápida, sensible de ROS, tienen serias limitaciones debido a señales artifactual, la incapacidad para calcular concentraciones de ROS y una falta general de especificidad1 .
Para facilitar el uso de EPR para estudios biológicos, una variedad de sondas se han sintetizado de la vuelta que puede medir una gama de especies de radicales libres biológicamente relevantes como pO2, pH y redox indica2,3, 4,5,6,7. Las trampas de la vuelta también se han desarrollado para capturar a los radicales de breve duración y larga vida forma aductos, que facilita la detección por APE8. Ambas clases (sondas de spin y spin trampas) tienen ventajas y limitaciones. Una clase comúnmente usada de puntas de prueba de giro son hydroxylamines cíclicas, EPR-silencioso y reaccionan con los radicales de breve duración para formar un nitróxido estable. Hydroxylamines cíclicos reaccionan con el superóxido 100 veces más rápido que las trampas de la vuelta, permitiéndoles competir con antioxidantes celulares, pero carecen de especificidad y requiere el uso de controles apropiados y los inhibidores para identificar la especie radical o fuente responsable de la señal de nitróxido. Mientras que spin trampas exhiben especificidad, con distintas espectral patrones dependiendo de la especie atrapada, tienen cinética lenta para superóxido spin reventado y son susceptibles a la biodegradación de la radical aductos. Aplicaciones para la captura de vuelta han sido bien documentados en la investigación biomédica9,10,11,12,13.
El objetivo de este proyecto es demostrar métodos prácticos de EPR para el diseño de experimentos y preparación de muestras para detectar superóxido usando puntas de prueba en diferentes compartimentos celulares in vitro y en compartimientos de tejido diferente en vivo. Varios manuscritos han publicado protocolos pertinentes a estos objetivos, usando puntas de prueba de giro objetivo permeable a la célula, célula impermeable y mitocondrial al tejido distintos compartimentos celulares in vitro y proceso para el análisis en modelos de ratón 14 , 15. construir sobre este cuerpo de literatura mediante la validación de un método para medir superóxido usando una sonda de spin 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) en diferentes compartimentos celulares en vitro para asegurar precisa medidas, destacando posibles problemas técnicos que pueden sesgar los resultados. También ofrecemos métodos para realizar mediciones de APE en sangre, lavado broncoalveolar y tejido pulmonar utilizando la punta de prueba de giro CMH. Estos estudios comparan diferentes métodos para procesar los tejidos, así como presentar un método para inyectar otra sonda de spin, CPH, en ratones antes de la cosecha de tejido. Finalmente, desarrollamos un método práctico para almacenar las muestras en tubos de politetrafluoretileno (PTFE) para permitir el almacenamiento y transferencia de muestras antes de las mediciones de EPR a 77 K.
Protocol
Representative Results
Discussion
La evaluación de la producción de radicales libres en entornos biológicos es importante en redox entendimiento reglamentado en salud y la enfermedad, pero la medida de estas especies es muy difícil debido a la corta vida media de las especies de radicales libres y técnicas limitaciones de los métodos comúnmente utilizados. EPR es una herramienta valiosa y poderosa en biología redox, ya que es el método sólo inequívoco para detectar radicales libres. En este proyecto demostramos métodos prácticos de EPR para …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Universidad de Colorado escuela de medicina Decano concesión de infraestructura de investigación estratégica, R01 HL086680-09 y 1R35HL139726-01, al Premio de beca E.N.G. y UCD CFReT (él). Los autores agradecen a Dr. Sandra Eaton y el Dr. Gareth Eaton (Universidad de Denver), Dr. Gerald Rosen y Dr. Joseph P. Kao (Universidad de Maryland) y Dr. Sujatha Venkataraman (Universidad de Colorado Denver) para discusiones útiles y Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie y Ivy McDermott (Universidad de Colorado Denver) para el soporte técnico.
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
Referencias
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