Burada, in vivo microdialysis EEG kayıtları ile birlikte epileptik ve sigara-epileptik sıçan ventral hipokampus glutamat ve aspartat sürümde analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ekstraselüler glutamat ve aspartat konsantrasyonu hastalık farklı aşamalarında ile ilişkili.
Microdialysis nörolojik aktif maddeler içine belgili tanımlık beyin interstisyel yer davranışı ile ve/veya belirli bir patoloji (Örneğin, nöbetler sonucu ile difüzyon değişiklikler ilişkili olan bir iyi kurulmuş nörolojik tekniktir Epilepsi için). Epilepsi okurken, microdialysis teknik genellikle kısa vadeli veya uzun vadeli bile video-spontan nöbet sıklığını, önem, ilerleme ve kümeleme değerlendirmek için izleme elektroansefalografi ile (EEG) birleştirilir. Kombine microdialysis EEG birkaç yöntem ve araçları kullanımına dayanır. Burada, vivo içinde microdialysis ve sürekli video-EEG zaman içinde epilepsi bir sıçan modelinde Doğal Tarih, farklı aşamalarını monitör glutamat ve aspartat çıkış için kayıt yapılır. Bu kombine yaklaşım nörotransmitter sürümde değişiklikler eşleştirme belirli aşamaları hastalığı gelişme ve ilerleme sağlar. Amino asit konsantrasyon diyalizat sıvı kromatografi tarafından tespit edilmiştir. Burada, asıl önlem bir in vivo microdialysis sırasında almalı anahat ve yöntemleri açıklayan-EEG, stereotaksik cerrahi özellikle dikkat edin, Bazal ve yüksek potasyum uyarı sırasında microdialysis, derinliği ile Elektrot EEG kaydı ve yüksek performanslı sıvı kromatografi Analizi içinde diyalizat glutamat ve aspartat. Bu yaklaşım adapte olabilir uyuşturucu ya da hastalık çeşitli test etmek için değişiklikleri, aspartat ve glutamat beyin fizyolojik konsantrasyonları indüklenen. Uygun bir analitik tahlil durumu bağlı olarak, daha fazla istihdam EEG kaydı aynı anda farklı çözünen molekülleri test etmek için kullanılabilir.
Biz sistematik olarak ekstrasellüler konsantrasyonları işlev bozukluğu glutamat aracılı eksitatör ve inhibitör neurotransmission temporal lob epilepsi (TLE) içinde spontan nöbetler sonuçlanan GABAergic içgörü sağlamak için izlenen GABA1 ve daha sonra glutamat ve aspartat2 fareler çeşitli noktalarda zaman-doğal hastalığının ventral hippocampus microdialysis tarafından düzeyde tabii ki, yani, gelişme ve ilerleme epilepsi sırasında. Biz çok doğru davranış, elektrofizyolojik ve histopatolojik değişiklikleri3,4 açısından hastalığı taklit eden TLE pilokarpin modeli içinde rats, avantaj aldı ve biz amino diyalizat konsantrasyonu korelasyon onun farklı aşamalarında asitler: akut faz epileptogenic hakaret, gecikme süresi faz, ilk spontan nöbet ve kronik phass5,6,7saat sonra. Hastalık aşama çerçeveleme uzun süreli video-EEG izleme ve hassas EEG ve spontan nöbetler klinik karakterizasyonu tarafından etkinleştirildi. Microdialysis teknik uygulama uzun süreli video-EEG bize TLE nevropatoloji için mekanik hipotezler evlenme izin izleme ile ilgili. Özet olarak, bu el yazması açıklanan teknik gelişme ve ilerleme hayvan modelinde epilepsi ile tanımlanmış beyin alanı içinde nörokimyasal değişiklikler eşleştirme sağlar.
Eþleþtirilmiþ cihazlar, microdialysis kanül için bitişik bir derinlik elektrot oluşan kez nerede nörotransmiterler, metabolitleri veya enerji yüzeylerde değişiklikleri için nöronal aktivite ilişkili olması epilepsi araştırma çalışmaları ve istihdam edilmektedir. Vakaların büyük çoğunluğu, serbestçe hayvanlar davranmak kullanılır ama benzer bir şekilde insanlar için Örneğin, derinlik elektrot soruşturma cerrahi8önce uygulanan pharmaco dayanıklı epileptik hastalarda da yapılabilir. EEG kaydı hem diyalizat toplama yapılabilir ayrı ayrı (bir yarımküre ve microdialysis elektrot yerleştirilmesiÖrneğin, yoklama diğer Yarımküre veya bile microdialysis yerine getirirken hayvanların bir grupta gerçekleştirme tek EEG hayvanların başka bir grupta). Ancak, elektrotlar probları için kaplin birden çok avantajları olabilir: stereotaksik cerrahi basitleştirir, doku hasarı sadece bir yarımküre için sınırlar (diğer bırakarak sağlam, histolojik araştırmalar denetimi olarak) ve bu sonuçları homogenizes aynı beyin bölgesi ve aynı hayvan–dan elde edilir.
Öte yandan, ev yapımı ise eşleşmiş microdialysis sonda-elektrot aygıt hazırlanması beceri ve zaman gerektirir. Bir piyasadan satın aldıysanız nispeten yüksek miktarlarda para harcayabilirsiniz. Ayrıca, ne zaman probları microdialysis (sonda ipuçları vardır genellikle 200-400 µm çapı ve 7-12 mm uzunluğunda)9ve EEG elektrotlar (elektrot ipuçları vardır genellikle faiz10beyin yapısını ulaşmak için 300-500 µm çapı ve yeterince uzun) birleştiğinde, takılı aygıt hayvanlar için zahmetli ve özellikle ne zaman o diyaliz pompa ve zor telli EEG kayıt sistemi ile bağlantılı olan kayıp olacak açıktır başın bir tarafında nispeten ağır ve hantal bir nesne temsil eder. Bu yönü daha zordur ve daha az microdialysis oturumları edinilmiş epileptik hayvanlarda alakalı. Uygun cerrahi teknik ve uygun ameliyat sonrası bakım birleşimsel microdialysis-EEG10,11, deneyleri için takip edilmelidir ve çok az hayvan rahatsızlık neden uzun süreli komponentlerde neden olur 12.
Avantajları ve microdialysis teknik sınırlamaları ayrıntılı olarak birçok nörologlar tarafından gözden geçirildi. Asıl avantaj diğer vivo içinde perfüzyon teknikleri (Örneğin, hızlı akış itme-çekme veya kortikal Kupası perfüzyon) üzerinden faiz13,14nispeten kesin bir alanı kapsayan sonda küçük çaplı olduğunu, 15. İkinci olarak, microdialysis membran doku ve perfusate arasında fiziksel bir bariyer oluşturur; Bu nedenle, yüksek moleküler ağırlık maddelerin değil çapraz ve analiz16,17ile müdahale değil. Ayrıca, doku perfusate18türbülanslı akış korunmaktadır. Başka bir önemli avantaj analit konsantrasyon perfusate maksimize etmek için perfusate akışını değiştirmek için olasılık var (yani, microdialysis süreci matematiksel olarak tanımlanabilir ve yüksek verim için değiştirilebilir örnekteki analit konsantrasyonları)19. Son olarak, teknik uyuşturucu veya farmakolojik aktif maddeler faiz dokusu içine demleyin ve müdahale20yerinde etkilerini belirlemek için kullanılabilir. Öte yandan, microdialysis elektrokimyasal veya biyolojik sensörleri ile karşılaştırıldığında sınırlı çözünürlük vakit (genellikle daha fazla zaman örnekleri toplamak için gerekli nedeniyle 1 dk) vardır; doku hasarına neden olan invaziv bir tekniktir; sürekli konsantrasyon gradyanı nedeniyle membran perfusate faiz analit ile birlikte girer boşluk tüm çözünür maddelerin içinde nörokimyasal dengesini ödün vermez. Son olarak, microdialysis teknik son derece perfusate9,21,22,23 maddelerin miktar için istihdam analitik teknikler sınırlarını etkilenir . Yüksek performanslı sıvı kromatografi (derivatization orthophthaldialdehyde biyolojik örnekler glutamat ve aspartat analizi ile de doğrulanmış24,25,26 edildikten sonra HPLC) , 27 ve onun kapsamlı tartışma bu yazının kapsamı dışında ancak bu yöntem kullanılarak üretilen veri ayrıntılı olarak açıklanacaktır.
Düzgün ve perfusate bileşimi değişiklik yapmadan gerçekleştirildiğinde microdialysis nörotransmitter yayın bazal düzeyleri hakkında güvenilir bilgi sağlar. Bazal düzeyleri en büyük bölümünü büyük olasılıkla verici yayılma sinapslarda9sonucudur. Birçok durumda ekstra sinaptik alanda nörotransmitter basit örnekleme bir soruşturma hedefleri takip için yeterli olmadığı için microdialysis tekniği de sinir hücreleri uyarmak için ya da onları önemli mahrum için istihdam edilebilir fizyolojik iyonları K+ veya Ca2 +, uyandırmak veya nörotransmitter sürümü önlemek için gibi.
Yüksek K+ stimülasyon kez Nörobiyoloji nöronal aktivite uyanık hayvanlarda hem de birincil ve organotypic kültürlerde uyarmak için kullanılır. Sağlıklı bir merkezi sinir sistemi K+ (40-100 mM) yüksek konsantrasyonları ile pozlama çözümlere nörotransmitter28sızma çağrıştırır. Yanıt-e doğru yüksek K+ ek bir sürümde sağlama yeteneği bu nöronların epileptik hayvanlar1 ve diğer nörodejeneratif hastalıkları29,30tehlikeye olabilir. Benzer şekilde, Ca (Ca2 + ücretsiz çözümleri ventriküler tarafından elde edilen)2 + yoksunluğu kalsiyum-bağımlı kurmak için kullanılan çoğu nörotransmitter microdialysis tarafından ölçülen piyasaya. Bu genellikle Ca2 + bağımlı yayın nöronal kökeni ise Ca2 + bağımsız yayın kaynaklanan glia ama birçok çalışma tartışmalara Ca2 +anlamı üzerinde yükseltilmiş olduğunu inanılıyor-hassas ölçümleri Örneğin glutamat veya GABA9: böylece, olanak varsa, bu ikinci yüksek uzaysal çözünürlük ve elektrotlar sağlar sinapslarda31olarak yakın almak için microsensor çalışmalar, microdialysis çalışmaları desteklemek için tavsiye edilir.
Epileptik hayvanlarda Microdialysis çalışmaları ile ilgili çoğu elde edilen veriler video veya video-EEG nöbetler, yani, işaretler ve/veya belirtiler nedeniyle anormal geçici oluşumunun izleme üzerine itimat stres önemlidir aşırı büyük ve zaman uyumlu nöronal faaliyette beyin32. Deneme hazırlarken dikkate alınması gereken tedavi pilokarpin hayvanlarda electrographic vakalarının bazı özellikleri vardır. Spontan nöbetler sık EEG interictal sivri3 depresyonda etkinlik tarafından takip edilmektedir ve kümeleri33,34oluşur. Sahte işletilen epileptik olmayan hayvanlar nöbet benzeri aktivite35 sergileyebilirler ve bu nedenle EEG kayıtları değerlendirme için parametreler standart36 olmalı ve, eğer olanaklı, microdialysis oturumları zamanlaması iyi tanımlanmış olmalıdır. Son olarak, çok son raporlarında37 Uluslararası lig karşı epilepsi ve Amerikan epilepsi Derneği uzmanları tarafından özetlenen ilkeleri ve video-EEG denetim yetişkin kemirgen izlemek için metodolojik standartları takip önerilir ,38.
Burada, microdialysis glutamat ve aspartat epileptik hayvanlarda uzun süreli video-EEG kayıtları ve HPLC göre diyalizat onların analizi ile paralel olarak açıklayın. Bir en iyi sonuç için halletmem protokol kritik adımları vurgulamak olacaktır.
Bu çalışmada, gösterdiğimiz microdialysis ile birleştiğinde sürekli video-EEG kaydı TLE deneysel bir model içinde nasıl gerçekleştirilebilir. Video-EEG kayıt teknikleri farklı aşamalarında hayvanlarda hastalık progresyon doğru olarak tanınabilmesi için kullanılır ve microdialysis tekniği (herhangi bir değişiklik için bulunmuştur sürede oluşan değişiklikleri glutamat sürümdeki açıklamak için kullanılır aspartat daha önce yayımlanmış çalışma2). Bunları …
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Anna Binaschi, Paolo Roncon ve Eleonora Palma öncelik sırasında yayınlanan el yazmaları katkılarından dolayı teşekkür etmek istiyorum.
3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
Altadol 50 mg/ ml – tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
Valium 10 mg/2 ml – diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |