Metoden ses här beskrivs utskrift av en samling av extracellulära proteiner i en microarray format, följt av en metod för screening av ett mål av intresse mot detta bibliotek. Vi har identifierat protein multimerization som ett avgörande steg för detektion av interaktioner som kännetecknas av låg bindande samhörighet. För att förbättra identifiering av interaktionerna, beskriver vi ett protokoll baserat på multimerization av proteinet frågan av intresse med mikrokulor.

Utsöndras och cell surface-uttryckta proteiner (kollektivt kallas extracellulära proteiner) tillsammans med sina samverkande partner är viktiga regulatorer av cellulär kommunikation, signalering och interaktion med mikromiljö. De är därför viktiga i regleringen av många fysiologiska och patologiska processer. Ungefär en fjärdedel av det mänskliga genomet (≈5, 000 proteiner) kodar för extracellulära proteiner, som, med tanke på deras betydelse och tillgänglighet till systematiskt levererade droger, representerar viktiga mål för drogen utveckling¹. Följaktligen utgör extracellulära proteiner mer än 70 procent av de protein mål med kända farmakologiska verkan för godkända läkemedel på marknaden, känd som det ”druggable proteomet”. Trots sin betydelse och överflöd fortfarande de extracellulära protein-protein interaktioner (ePPI) nätverk anmärkningsvärt underrepresenterade i de tillgängliga databaserna. Detta är i grunden på grund av komplexa biokemiska karaktär av extracellulära proteiner, vilket utesluter deras karakterisering som använder mest tillgängliga teknik². För det första är membranproteiner svåra att solubilize, en process som ofta innebär hårda tvätt villkor och rengöringsmedel; för det andra saknar extracellulära proteiner ofta relevant post-translationella modifieringar såsom glycosylation som är frånvarande när dessa proteiner uttrycks i vanligen används heterologa system. Slutligen, interaktioner mellan receptorer som samtidig receptorer uttrycks på immunceller, är ofta övergående och kännetecknas av mycket låg affinitet (K-_D i den ~ 1 μM till > 100 μM utbud). Alldeles, arten av dessa proteiner och deras bindning partners göra mest utnyttjade teknik, såsom affinitet rening/masspektrometri (AP/MS) eller jäst-två-hybrid, olämpliga för detektion av interaktioner i extracellulära ^{2 , 3}.

I ett försök att övervinna dessa tekniska utmaningar och påskynda upptäckten av nya interaktioner för extracellulära proteiner, har vi utvecklat en hög täckning extracellulära protein microarray^4,5. Microarrays fördelen med generera hög densitet ytor med små mängder prov och är allmänt mottagliga för hög genomströmning studier. Protein microarray-baserade studier har tidigare lämnat relevanta insikter proteininteraktioner för flera modellorganismer, om än främst fokusera på cytosoliska interaktioner eller specifikt protein familjer^{6,7, 8}. Däremot har begränsad arbete gjorts för att undersöka extracellulära proteininteraktioner med denna teknik. Vi har utvecklat en protein microarray metod för att möjliggöra studier av ePPIs genom att bygga ett omfattande och mycket olikartade bibliotek av renade proteiner från utsöndras och enda transmembrana (STM) receptorer uttrycks som rekombinant extracellulära domäner (ECD) smält till vanliga taggar för affinitet rening⁴. Framgången för protein microarray skärmarna är starkt beroende av inrättandet av en hög kvalitet protein library. Uttryck för både bibliotek och fråga protein valdes däggdjursceller eller insekt celler prioriterat som heterologa uttryck system, att säkerställa korrekt tillägg av post-translationella modifieringar som glycosylation eller disulphide obligationer. SDS-PAGE, storlek utslagning kromatografi och flera vinklar laserljus spridning är tekniker som ofta används för att bedöma rekombinant proteinkvalitet. Protein biblioteket sedan fläckig på epoxysilane bilder och lagras vid-20 ° C för långvarig användning. Protein koncentrationer över 0,4 mg/ml rekommenderas för det protokoll som beskrivs nedan. Låg-uttryckande proteiner kan därför kräva en koncentration steg före provet utskrift och lagring. En största fördelen med denna teknik är dock den lilla volymen av protein krävs (50 μg av protein är tillräckligt att utföra > 2.000 skärmar), tillsammans med minimal fråga protein konsumtion (20-25 μg per dubbletter skärm). Med hjälp av protokoll och utrustning som beskrivs här, och förutsatt att biblioteken är tillgängliga, resultat för enskilda fråga proteiner kan genereras inom en arbetsdag.

En stor utmaning i att upptäcka proteininteraktioner i den extracellulära miljön uppstår från deras egenskapt svag eller övergående natur, vilket utesluter identifiering av de vanligaste metoderna. Öka den bindande aviditet kraftigt förbättrar känsligheten för upptäckt av svag protein interaktioner^9,10,11. Baserat på denna princip som vi utvecklat en metod att multimerize frågan proteinerna (uttryckt som Fc fusion) använder protein A-belagd pärlor^4,5. För att undvika eventuella potentiella inaktivering av proteinet fråga av slumpmässiga märkning, vi istället etikett en irrelevant humant immunglobulin G med Cy5 och Lägg tillsammans med proteinet fråga till protein A pärlorna, vilket eliminerar alla artefakter på grund av den direkta konjugering av en färga till proteinet av intresse. Med tanke på de mikromolära tillhörighet av flera samtidig receptor par, öka de multivalenta komplex kraftigt signal-brus-förhållande, jämfört med Fc-fråga fusionsproteinerna screening som lösliga proteiner⁴.

Sammanfattningsvis är syftet med detta protokoll att beskriva utarbetandet av microarray bilder som innehåller ett befintligt extracellulära protein bibliotek för identifiering av receptor-ligand interaktioner. Vi granskar stegen för bild utskrift, följt av ett protokoll för screening av ett protein av intresse mot den extracellulära protein library. Dessutom beskriver vi en metod för förbättrad detektion av ePPIs baserat på mikrokulor att uppnå ökade aviditet av protein under studien. Den extracellulära protein Mikroarrayteknik beskrivs här representerar en snabb, robust och effektiv metod för screening och upptäcka nya ePPI med låg falskt positiva förhållanden och genom att utnyttja bara mikrogram kvantiteter av proteinet fråga under utredning. Denna teknik har underblåst flera studier som har gett relevanta insikter om tidigare okända cellfunktioner och signalvägar för en mängd olika receptorer^12,13, inklusive viral immunoregulators¹⁴, och kan utnyttjas för att de orphanize något extracellulära protein av intresse.