यहां, हम उच्च प्रवाह में उपंयास रिसेप्टर ligand बातचीत की पहचान के लिए स्क्रीन extracellular प्रोटीन microarrays के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम भी प्रोटीन-microbead परिसरों का उपयोग करके क्षणिक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का पता लगाने को बढ़ाने के लिए एक विधि का वर्णन ।
स्रावित कारकों, झिल्ली सीमित रिसेप्टर्स, और उनके बातचीत भागीदारों सेलुलर संचार और homeostasis और रोग के दौरान कैस्केडिंग संकेत की दीक्षा के मुख्य नियामकों हैं, और इस तरह के रूप में प्रधानमंत्री चिकित्सीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं. उनकी प्रासंगिकता के बावजूद, इन संपर्क नेटवर्क मौजूदा डेटाबेस में काफी प्रतिनिधित्व रह; इसलिए, सबसे extracellular प्रोटीन कोई प्रलेखित बाध्यकारी भागीदार है । यह विसंगति मुख्य रूप से कार्यात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति सहित extracellular प्रोटीन के अध्ययन के साथ जुड़े चुनौतियों के कारण है, और कमजोर, कम अपनत्व, प्रोटीन बातचीत अक्सर सेल सतह रिसेप्टर्स के बीच स्थापित. इस पद्धति का उद्देश्य प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की स्क्रीनिंग के लिए microarray स्वरूप में extracellular प्रोटीन्स की एक लाइब्रेरी की छपाई का वर्णन करना है. कमजोर बातचीत का पता लगाने को सक्षम करने के लिए, एक अध्ययन के तहत क्वेरी प्रोटीन के multimerization पर आधारित विधि वर्णित है । वृद्धि हुई multivalency के लिए इस microbead आधारित multimerization दृष्टिकोण के लिए युग्मित, प्रोटीन microarray उच्च प्रवाह में क्षणिक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का मजबूत पता लगाने की अनुमति देता है । इस विधि किसी भी extracellular प्रोटीन के लिए लागू नए बातचीत की पहचान के लिए एक तेजी से और कम नमूना लेने-दृष्टिकोण प्रदान करता है. प्रोटीन microarray प्रिंटिंग और स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल बताए गए हैं । यह तकनीक extracellular अंतरिक्ष में प्रोटीन इंटरैक्शन की खोज के लिए एक दमदार विधि की मांग करने वाले जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होगी ।
इस विधि की समीक्षा यहां एक microarray प्रारूप में extracellular प्रोटीन का एक संग्रह के मुद्रण का वर्णन करता है, इस पुस्तकालय के खिलाफ ब्याज की एक लक्ष्य की स्क्रीनिंग के लिए एक विधि द्वारा पीछा किया । हम कम बाध्यकारी समानताएं द्वारा विशेषता बातचीत का पता लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में प्रोटीन multimerization की पहचान की है । इन बातचीत का पता लगाने को बढ़ाने के लिए, हम एक microbeads का उपयोग ब्याज की क्वेरी प्रोटीन के multimerization के आधार पर प्रोटोकॉल का वर्णन ।
गुप्त और कोशिका की सतह-व्यक्त प्रोटीन (सामूहिक रूप से extracellular प्रोटीन) के साथ साथ उनके बातचीत भागीदारों सेलुलर संचार के प्रमुख नियामकों हैं, संकेतन और microenvironment के साथ बातचीत । वे कर रहे हैं, इसलिए, कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं को विनियमित करने में आवश्यक. मानव जीनोम के लगभग एक चौथाई (≈ ५,००० प्रोटीन) extracellular प्रोटीन है, जो, उनके महत्व और व्यवस्थित दवाओं के लिए पहुंच दिया, दवा के विकास के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करने के लिए encodes1। नतीजतन, extracellular प्रोटीन बाजार पर अनुमोदित दवाओं के लिए ज्ञात औषधीय कार्रवाई के साथ प्रोटीन लक्ष्य के ७०% से अधिक प्रतिनिधित्व करते हैं, “druggable proteome” के रूप में जाना जाता है । उनके महत्व और बहुतायत के बावजूद, extracellular प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन (एपपि ने) नेटवर्क उपलब्ध डेटाबेस में उल्लेखनीय रूप से प्रतिनिधित्व करते रहते हैं । यह मौलिक extracellular प्रोटीन है, जो सबसे उपलब्ध प्रौद्योगिकियों2का उपयोग कर अपने लक्षण वर्णन precludes के जटिल जैव रासायनिक प्रकृति के कारण है । सबसे पहले, झिल्ली प्रोटीन solubilize, एक प्रक्रिया है कि अक्सर कठोर धोने की स्थिति और डिटर्जेंट शामिल करने के लिए मुश्किल है; दूसरे, extracellular प्रोटीन अक्सर ऐसे glycosylation के रूप में प्रासंगिक पोस्ट अनुवाद संशोधनों की कमी है कि अनुपस्थित रहे है जब इन प्रोटीन आमतौर पर इस्तेमाल किया heterologous प्रणालियों में व्यक्त कर रहे हैं । अंत में, रिसेप्टर्स के बीच बातचीत, जैसे सह के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर व्यक्त रिसेप्टर्स, अक्सर क्षणिक होते हैं और बहुत कम समानताएं द्वारा विशेषता (KD में ~ 1 माइक्रोन के लिए > 100 माइक्रोन रेंज). कुल मिलाकर, इन प्रोटीन और उनके बाध्यकारी भागीदारों की प्रकृति इस तरह के संबंध शुद्धि के रूप में सबसे व्यापक रूप से उपयोग प्रौद्योगिकियों, रेंडर/मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी/MS) या खमीर-दो-संकर, extracellular अंतरिक्ष में बातचीत का पता लगाने के लिए अनुपयुक्त 2 , 3.
इन तकनीकी चुनौतियों को दूर करने और extracellular प्रोटीन के लिए उपंयास बातचीत की खोज में तेजी लाने के प्रयास में, हम एक उच्च कवरेज extracellular प्रोटीन microarray4,5विकसित किया है । Microarrays नमूना की छोटी मात्रा के साथ उच्च घनत्व सतहों पैदा करने का लाभ प्रदान करते हैं, और आम तौर पर उच्च प्रवाह अध्ययन के लिए उत्तरदायी हैं । प्रोटीन microarray आधारित अध्ययन पहले कई मॉडल जीवों के लिए प्रोटीन बातचीत में प्रासंगिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है, हालांकि मुख्य रूप से cytosolic बातचीत या विशिष्ट प्रोटीन परिवारों पर ध्यान केंद्रित6,7, 8. इसके विपरीत इस तकनीक का इस्तेमाल करते हुए extracellular प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए सीमित काम किया गया है । हम एक प्रोटीन microarray विधि विकसित की है एक व्यापक और अत्यधिक विविध पुस्तकालय के निर्माण द्वारा ePPIs के अध्ययन को सक्षम शुद्ध स्रावित प्रोटीन और एकल transmembrane (STM) रिसेप्टर्स रिकॉमबिनेंट extracellular डोमेन (ECD) के रूप में व्यक्त करने के लिए जुड़े समानता शुद्धि के लिए आम टैग4. प्रोटीन microarray स्क्रीन की सफलता एक उच्च गुणवत्ता प्रोटीन पुस्तकालय की स्थापना पर भारी निर्भर करता है । पुस्तकालय और क्वेरी प्रोटीन दोनों की अभिव्यक्ति के लिए, स्तनधारी कोशिकाओं या कीट कोशिकाओं को तरजीही रूप से heterologous एक्सप्रेशन सिस्टम के रूप में चुना गया था, glycosylation या disulphide बांड जैसे पोस्ट-शोधों संशोधनों के उचित अतिरिक्त सुनिश्चित करने के लिए. एसडीएस-पृष्ठ, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी और बहु कोण लेजर प्रकाश कैटरिंग तकनीक सामांयतः रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रोटीन पुस्तकालय तो epoxysilane स्लाइड पर देखा जाता है और लंबी अवधि के उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । ०.४ मिलीग्राम/एमएल के ऊपर प्रोटीन सांद्रता नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के लिए सिफारिश की है । इसलिए, कम व्यक्त प्रोटीन एक एकाग्रता कदम से पहले नमूना मुद्रण और भंडारण की आवश्यकता हो सकती है । फिर भी, इस तकनीक का एक मुख्य लाभ की आवश्यकता प्रोटीन की छोटी मात्रा है (५० प्रोटीन की μg > 2000 स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है), न्यूनतम क्वेरी प्रोटीन की खपत के साथ (20-25 μg प्रति डुप्लिकेट स्क्रीन). प्रोटोकॉल और उपकरणों का उपयोग यहां वर्णित है, और प्रदान की पुस्तकालयों उपलब्ध हैं, व्यक्तिगत क्वेरी प्रोटीन के लिए परिणाम एक कार्य दिवस के भीतर उत्पंन किया जा सकता है ।
extracellular वातावरण में प्रोटीन बातचीत का पता लगाने में एक प्रमुख चुनौती उनके विशिष्ट रूप से कमजोर या क्षणिक प्रकृति है, जो सबसे अधिक इस्तेमाल के तरीके से precludes पहचान से उठता है । बाध्यकारी avid बहुत कमजोर प्रोटीन बातचीत9,10,11का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि. इस सिद्धांत के आधार पर हम क्वेरी प्रोटीन multimerize करने के लिए एक विधि विकसित (एफसी फ्यूजन के रूप में व्यक्त) प्रोटीन a-लेपित मोती4,5का उपयोग कर । यादृच्छिक लेबलिंग द्वारा क्वेरी प्रोटीन की किसी भी संभावित निष्क्रियता से बचने के लिए, हम बजाय Cy5 के साथ एक अप्रासंगिक मानव immunoglobulin जी लेबल और यह प्रोटीन एक मोतियों के लिए क्वेरी प्रोटीन के साथ जोड़ने के लिए, इस प्रकार के प्रत्यक्ष विकार के कारण किसी भी कलाकृतियों को नष्ट करने प् याज के प्रोटीन को डाई करें । कई सह रिसेप्टर जोड़े के micromolar समानताएं को देखते हुए, multivalent परिसरों बहुत शोर अनुपात करने के लिए संकेत को बढ़ाने, एफसी-फ्यूजन क्वेरी प्रोटीन घुलनशील प्रोटीन के रूप में जांच की तुलना में4.
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य रिसेप्टर-ligand बातचीत की पहचान के लिए एक पूर्व मौजूदा extracellular प्रोटीन पुस्तकालय युक्त microarray स्लाइड की तैयारी का वर्णन करने के लिए है. हम स्लाइड मुद्रण, extracellular प्रोटीन पुस्तकालय के खिलाफ ब्याज की एक प्रोटीन की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल के बाद के लिए चरणों की समीक्षा करें । इसके अलावा, हम अध्ययन के तहत प्रोटीन की वृद्धि की शौकीनता को प्राप्त करने के लिए microbeads के आधार पर ePPIs के बढ़ाया पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन । extracellular प्रोटीन microarray प्रौद्योगिकी यहां वर्णित एक तेज, मजबूत और प्रभावी जांच और कम झूठी सकारात्मक अनुपात के साथ उपंयास एपपि ने का पता लगाने के लिए दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, और क्वेरी प्रोटीन के तहत केवल माइक्रोग्राम मात्रा का उपयोग करके जांच. इस प्रौद्योगिकी के कई अध्ययनों है कि पहले से अज्ञात सेलुलर कार्यों में प्रासंगिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है ईंधन है और12,13वायरल immunoregulators14सहित रिसेप्टर्स की एक किस्म के लिए संकेत रास्ते, और de-orphanize ब्याज की किसी भी extracellular प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है ।
अनाथ रिसेप्टर्स की एक महत्वपूर्ण संख्या मानव जीनोम में रहते हैं, और उपंयास बातचीत भागीदारों के लिए पहले से लाइगैंडों विशेषता के साथ extracellular प्रोटीन के लिए उभरने के लिए जारी है । मानव और मॉडल जीवों में रिस…
The authors have nothing to disclose.
हम गंभीर पांडुलिपि पढ़ने के लिए Philamer cals और कोबे यूएन धंयवाद । हम उत्कृष्ट तकनीकी सलाह के लिए रेंडी येन के लिए आभारी हैं ।
Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |