De hier besproken methode beschrijft het afdrukken van een verzameling van extracellulaire eiwitten in een microarray opmaken, gevolgd door een methode voor screening van een doelwit van belang tegen deze bibliotheek. We hebben eiwit multimerization aangewezen als een cruciale stap voor de detectie van interacties gekenmerkt door lage bindende verwantschappen. Om detectie van deze interacties te verbeteren, beschrijven we een protocol op basis van multimerization van de query-proteïne van belang met behulp van microbeads.

Uitgescheiden en cel oppervlak-uitgedrukt eiwitten (collectief genoemd extracellulaire eiwitten) samen met hun interactie partners zijn belangrijke regulatoren van cellulaire communicatie, signalering en interactie met de communicatie. Ze zijn daarom essentieel bij het reguleren van veel fysiologische en pathologische processen. Ongeveer een kwart van het menselijk genoom (≈5, 000 eiwitten) codeert voor extracellulaire eiwitten, die, gezien hun betekenis en toegankelijkheid aan systematisch geleverde drugs, vertegenwoordigen belangrijke doelen voor drug ontwikkeling¹. Bijgevolg, extracellulaire eiwitten vertegenwoordigen meer dan 70% van het eiwit doelen met bekende farmacologische werking voor goedgekeurde geneesmiddelen op de markt, bekend als de “druggable Proteoom”. Ondanks hun belang en overvloed blijven de extracellulaire eiwit-eiwit-interactienetwerken (ePPI) opmerkelijk ondervertegenwoordigde in de beschikbare databases. Dit is fundamenteel te wijten aan de complexe biochemische aard van de extracellulaire eiwitten, die zich verzet tegen hun karakterisering met behulp van de meeste beschikbare technologieën². In de eerste plaats zijn membraaneiwitten moeilijk te solubilize, een proces dat vaak hard wassen voorwaarden en detergentia gaat; Ten tweede, extracellulaire eiwitten vaak geen relevante posttranslationele modificaties zoals glycosylatie die zijn afwezig wanneer deze eiwitten worden uitgedrukt in algemeen gebruikte heterologe systemen. Ten slotte, interacties tussen receptoren, zoals co receptoren uitgedrukt op immune cellen, zijn vaak van voorbijgaande aard en gekenmerkt door zeer lage affiniteit (K_D in de ~ 1 micrometer tot > 100 μM-bereik). Over het geheel genomen de aard van deze eiwitten en hun bindende partners maken het wijdst gebruikt technologieën, zoals affiniteit zuivering/massaspectrometrie (AP/MS) of gist-twee-hybride, ongeschikt voor detectie van interacties in de extracellulaire ruimte ^{2 , 3}.

In een poging deze technische uitdagingen te overwinnen en de ontdekking van nieuwe interacties voor extracellulaire eiwitten versnellen, hebben we een hoge dekking extracellulaire eiwit microarray^4,5. Microarrays bieden het voordeel van het genereren van high-density oppervlakken met kleine hoeveelheden van het monster, en zijn over het algemeen vatbaar voor hoge doorvoer studies. Eiwit microarray gebaseerde studies hebben eerder verstrekte relevante inzichten in eiwitinteractie voor verscheidene modelorganismen, zij het hoofdzakelijk gericht op cytosolische interacties of op specifieke proteïne gezinnen^{6,7, 8}. Daarentegen heeft beperkt gewerkt om te onderzoeken van extracellulaire eiwitinteractie met behulp van deze technologie. We hebben een eiwit microarray methode ontwikkeld om bestudering van ePPIs mogelijk te maken door het bouwen van een uitgebreide en zeer divers bibliotheek van gezuiverde secreted eiwitten en één transmembraan (STM) receptoren uitgedrukt als recombinante extracellulaire domeinen (ECD) tot gesmolten gemeenschappelijke tags voor affiniteit zuivering⁴. Het succes van de eiwit microarray schermen leunt op de oprichting van een hoge kwaliteit eiwit bibliotheek. Voor de uitdrukking van de bibliotheek en de query eiwit, werden zoogdiercellen of insect cellen bij voorkeur gekozen als heterologe expressiesystemen, om goede toevoeging van posttranslationele modificaties zoals glycosylatie of dissulfide bindingen. SDS-pagina, grootte uitsluiting chromatografie en multi hoek laserlicht verstrooiing zijn technieken die vaak gebruikt om te beoordelen van de kwaliteit van recombinante eiwitten. De eiwit-bibliotheek is dan gespot in epoxysilane dia’s en opgeslagen bij-20 ° C voor langdurig gebruik. Eiwit concentraties boven van 0,4 mg/mL worden aanbevolen voor het protocol die hieronder worden beschreven. Daarom uiten van lage eiwitten mogelijk een concentratie stap vóór monster afdrukken en opslag. Een belangrijkste voordeel van deze techniek is echter de kleine hoeveelheid eiwit nodig (50 μg van eiwit is voldoende om uit te voeren > 2.000 schermen), naast de minimale query eiwit consumptie (20-25 μg per duplicaten scherm). Met behulp van het protocol en de apparatuur die hier worden beschreven, en mits de bibliotheken beschikbaar zijn, resultaten voor afzonderlijke query eiwitten binnen één werkdag kunnen worden gegenereerd.

Een grote uitdaging voor het opsporen van eiwitinteractie in de extracellulaire omgeving vloeit voort uit hun typisch zwak of voorbijgaande aard, die zich verzet tegen de identificatie door de meest gebruikte methoden. Uitbreiding van de bindende avidity sterk verbetert de gevoeligheid voor de detectie van zwakke eiwit interacties^9,10,11. Gebaseerd op dit principe ontwikkelden we een methode om multimerize de query eiwitten (uitgedrukt als Fc fusion) met behulp van eiwit A beklede kralen^4,5. Om te voorkomen dat elke potentiële inactivering van het query-eiwit door willekeurige labeling, wij in plaats daarvan een irrelevant menselijk immunoglobuline met Cy5 label en erbij samen met de query-eiwit moet de EiwitA kralen, waardoor alle artefacten als gevolg van de directe vervoeging van een kleurstof voor de proteïne van belang. Gezien de micromolar verwantschappen van verschillende co receptor paren, verbeteren de multivalent complexen sterk signaal / ruisverhouding, in vergelijking met Fc-fusion query eiwitten gescreend als oplosbare eiwitten⁴.

Kortom is het doel van dit protocol voor het beschrijven van de voorbereiding van microarray dia’s met een bestaande bibliotheek van extracellulaire proteïne voor identificatie van receptor-ligand interacties. We bekijken de stappen voor dia afdrukken, gevolgd door een protocol voor screening van een proteïne van belang tegen de extracellulaire proteïne-bibliotheek. Daarnaast beschrijven we een methode voor de verbeterde detectie van ePPIs gebaseerd op microbeads om hogere avidity van de eiwitten bestudeerde. De extracellulaire eiwit microarray technologie hier beschreven vertegenwoordigt een snelle, krachtige en effectieve benadering van screening en opsporen van roman ePPI met lage vals-positieve ratio’s, en door gebruik te maken van enige microgram hoeveelheden van het query-eiwit onder onderzoek. Deze technologie heeft aangewakkerd meerdere studies die relevante inzichten in voorheen onbekende cellulaire functies en signaalroutes hebben gezorgd voor een verscheidenheid van receptoren^12,13, met inbegrip van virale immunoregulators¹⁴, en kan worden gebruikt om de orphanize elke extracellulaire proteïne van belang.