Metoden omtalt her beskriver utskrift av en samling av ekstracellulære proteiner i et microarray format, etterfulgt av en metode for screening av et mål av interesse mot dette biblioteket. Vi har identifisert protein multimerization som et viktig skritt for påvisning av interaksjoner preget av lav bindende slektskap. For å forbedre gjenkjenning av disse interaksjoner, beskriver vi en protokoll basert på multimerization av spørringen protein rundt ved hjelp av microbeads.

Skilles ut celle overflaten-uttrykt proteiner (kollektivt kalt ekstracellulære proteiner) sammen med samarbeidspartnerne samhandlende er viktige regulatorer av mobil kommunikasjon, signalisering og samspill med microenvironment. De er derfor viktige i å regulere mange fysiologiske og patologiske prosesser. Omtrent en fjerdedel av det menneskelige genomet (≈5, 000 proteiner) koder for ekstracellulære proteiner, som, gitt deres betydning og tilgjengelighet til systematisk leverte narkotika, representerer viktige mål for narkotika utvikling¹. Følgelig representerer ekstracellulære proteiner mer enn 70% av protein mål med kjente farmakologisk handling for godkjente legemidler på markedet, kjent som “druggable proteom”. Til tross for deres betydning og overflod forblir den ekstracellulære protein-protein interaksjon (ePPI) nettverk bemerkelsesverdig underrepresentert i tilgjengelige databaser. Dette er fundamentalt komplekse biokjemiske innholdet i de ekstracellulære proteinene, som utelukker sin karakteristikk bruker mest tilgjengelige teknologier². Først er membran proteiner vanskelig å solubilize, en prosess som involverer ofte harde vask forhold og vaskemidler; Dernest mangler ekstracellulære proteiner ofte relevante post-translasjonell modifikasjoner som glykosylering som er fraværende når disse proteinene er uttrykt i vanligvis brukt heterologous systemer. Til slutt, samspillet mellom reseptorer, som co reseptorer uttrykt på immunceller, er ofte midlertidig og preget av svært lav slektskap (K_D i ~ 1 μM til > 100 μM utvalg). Sammen benyttet disse proteinene og deres bindende partnere gjengi mest teknologi, for eksempel rensing/massespektrometri med affinitet (AP/MS) eller gjær-to-hybrid, uegnet for påvisning av interaksjoner i ekstracellulære plass ^{2 , 3}.

I et forsøk på å overvinne disse tekniske utfordringer og akselerere oppdagelsen av romanen samhandlinger for ekstracellulære proteiner, har vi utviklet en høy dekning ekstracellulære protein microarray^4,5. Microarrays tilbyr fordelen av generere høy tetthet overflater med små mengder av prøven, og er generelt mottakelig for høy gjennomstrømning studier. Protein microarray-baserte studier har tidligere gitt relevant innsikt i protein interaksjoner for flere modell organismer, men hovedsakelig fokuserer på cytosolic interaksjoner eller bestemt protein familier^{6,7, 8}. Sammenligning har begrenset arbeid blitt gjort for å undersøke ekstracellulære protein interaksjoner ved hjelp av denne teknologien. Vi har utviklet en protein microarray metode for å aktivere studier av ePPIs ved å bygge en omfattende og svært variert bibliotek av renset utskilles proteiner og enkelt transmembrane (STM) reseptorer uttrykt som rekombinant ekstracellulære domener (ECD) del felles koder for affinitet rensing⁴. Suksessen av protein microarray skjermene stoler tungt på etablering av et høykvalitets protein bibliotek. For uttrykk for både bibliotek og spørring protein, pattedyrceller eller insekt celler var preferentially valgt heterologous uttrykk systemer, å sikre riktig tillegg post-translasjonell modifikasjoner som glykosylering eller disulphide obligasjoner. SDS side, størrelse utelukkelse kromatografi og multivinkel laserlys spredning er teknikker vanligvis benyttes for å vurdere rekombinant protein kvalitet. Protein biblioteket deretter oppdaget på epoxysilane lysbilder og lagret på 20 ° C for langsiktig bruk. Protein konsentrasjoner over 0,4 mg/ml er anbefalt for protokollen beskrevet nedenfor. Derfor krever lav-uttrykke proteiner litt konsentrasjon før eksempel utskrift og lagring. Likevel en viktig nytte av denne teknikken er små volumet av protein kreves (50 μg protein er tilstrekkelig til å utføre > 2000 skjermer), sammen med minimal spørringen protein konsum (20-25 μg per duplikater skjermen). Ved hjelp av protokollen og utstyr beskrevet her, og bibliotekene er tilgjengelig, resultater for individuelle spørringen proteiner kan genereres innen én virkedag.

En stor utfordring i å oppdage protein interaksjoner i ekstracellulære miljøet oppstår fra deres karakteristisk svak eller forbigående Art, som utelukker identifikasjon av mest brukte metoder. Økende bindende avidity sterkt forbedrer følsomhet for gjenkjenning av svak protein interaksjoner^9,10,11. Basert på dette prinsippet vi utviklet en metode for å multimerize spørring proteiner (uttrykt som Fc fusion) bruke protein A-belagt perler^4,5. For å unngå noen potensielle inaktivering av spørringen protein ved tilfeldig merking, vi i stedet merke en irrelevante menneskelige immunglobulin G med Cy5 og legge den sammen med spørringen protein til protein A perler, dermed eliminere noen gjenstander på grunn av den direkte Bøyning av en fargestoff protein av interesse. Gitt de micromolar slektskap av flere co reseptor, forbedre multivalent komplekser kraftig signal til støyforhold, sammenlignet med Fc-fusion spørringen proteiner vist som løselig proteiner⁴.

Oppsummert er målet med denne protokollen til å beskrive utarbeidelse av microarray lysbilder som inneholder et eksisterende ekstracellulære protein bibliotek for identifikasjon av reseptor-ligand interaksjoner. Vi går gjennom trinnene for lysbildet utskrift, etterfulgt av en protokoll for screening av et protein av interesse mot ekstracellulære protein biblioteket. Videre beskriver vi en metode for bedre gjenkjenning av ePPIs basert på microbeads å oppnå økt avidity av proteinet under studien. Den ekstracellulære protein microarray teknologien beskrevet her representerer en rask, robust og effektiv tilnærming til screening og oppdage romanen ePPI med lav false-positiv forholdstall, og ved å bruke bare mikrogram mengder spørringen protein under gransking. Denne teknologien har drevet flere studier som har gitt relevant innsikt i tidligere ukjent cellulære funksjoner og signalnettverk trasé for en rekke reseptorer^12,13, inkludert viral immunoregulators¹⁴, og kan brukes til å orphanize de alle ekstracellulære protein av interesse.