השיטה שנסקרו כאן מתאר ההדפסה של אוסף של חלבונים חוץ-תאית בתבנית microarray, ואחריו שיטה להקרנה של מטרה עניין נגד בספריה זו. זיהינו את החלבון multimerization כצעד מכריע לצורך זיהוי של אינטראקציות מאופיין על ידי איגוד נמוך הזיקות. כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות אלה, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס על multimerization של החלבון שאילתה עניין באמצעות גרגרי.

מופרש, תא השטח הביע חלבונים (הנקרא באופן קולקטיבי חלבונים חוץ-תאית) יחד עם שותפים שמעצבת את הרגולטורים מפתח תקשורת סלולרית, איתות ואינטראקציה עם microenvironment. הם חיוניים, לכן, בוויסות תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים. בערך רבע של הגנום האנושי (≈5, 000 חלבונים) מקודד חלבונים חוץ-תאית, אשר, בהתחשב שלהם משמעות, נגישות לתרופות מועברות באופן שיטתי, מייצגים מטרות המפתח עבור פיתוח תרופה¹. כתוצאה מכך, חוץ-תאית חלבונים מייצגים יותר מ 70% של המטרות חלבון עם פעולה תרופתי ידוע עבור תרופות שאושרו על השוק, המכונה “פרוטאום druggable”. למרות החשיבות שלהם, שפע, הרשתות אינטראקציה (אפי) חלבון חוץ-תאית נשארים להפליא underrepresented במסדי הנתונים הזמינים. . זאת באופן מהותי בשל האופי הביוכימי המורכב של החלבונים חוץ-תאית, שמונע את האפיון שלהם באמצעות טכנולוגיות הזמינה ביותר²… ראשית, קרום חלבונים קשים solubilize, תהליך זה כרוך לעתים קרובות תנאים קשים כביסה וחומרי ניקוי; שנית, חלבונים חוץ-תאית לעתים קרובות חוסר שינויים post-translational רלוונטי כגון גליקוזילציה כי הם נעדרים כאשר חלבונים אלה באים לידי ביטוי נפוץ המשמש במערכות heterologous. בסופו של דבר, אינטראקציות בין רצפטורים, כגון קולטנים לעבודה הביעו על תאים חיסוניים, הם לעיתים קרובות ארעי, המאופיינת הזיקות נמוך מאוד (K_D μM ~ 1 ל > 100 μM טווח). בסך הכל, הטבע של חלבונים אלה ואיגוד שלהם שותפים רינדור נרחב ביותר מנוצל טכנולוגיות, כגון זיקה טיהור/ספקטרומטריית (AP/MS) או שמרים-שני-היברידית, מתאימים לצורך זיהוי של אינטראקציות במרחב חוץ-תאית ^{2 , 3}.

בניסיון להתגבר על אתגרים טכניים אלה ולהאיץ את הגילוי של אינטראקציות הרומן חלבונים חוץ-תאית, פיתחנו^4,5microarray חלבון חוץ-תאית כיסוי גבוהה. מיקרו-מערכים מציעים את היתרון של יצירת משטחים בצפיפות גבוהה עם כמויות קטנות של המדגם, נתונות בדרך כלל מחקרים תפוקה גבוהה. חלבון מבוססי microarray מחקרים בעבר סיפקו תובנות רלוונטיות אינטראקציות חלבון עבור אורגניזמים מספר דגם, אמנם בעיקר תוך התמקדות על אינטראקציות cytosolic או חלבון ספציפי משפחות^{6,7, 8}. לעומת זאת, עבודה מוגבל סיים לחקור אינטראקציות חלבון חוץ-תאית באמצעות טכנולוגיה זו. פיתחנו שיטה microarray חלבון כדי לאפשר מחקרים של ePPIs על ידי בניית ספרייה מקיפה ומגוונת מאוד של חלבונים מטוהרים המופרש והביע קולטנים (STM) transmembrane יחיד רקומביננטי כמו תחומים חוץ-תאית (ECD) מחובר לגבו תגיות נפוצות עבור טיהור זיקה⁴. ההצלחה של המסכים microarray חלבון מתבסס בעיקר על הקמת ספריה חלבון באיכות גבוהה. ביטוי של חלבון ספריית והן השאילתה, בתרבית של תאים או תאים חרקים מעדיפים נבחרו כמערכות ביטוי heterologous, כדי להבטיח תוספת נכונה של שינויים post-translational כגון אגרות חוב גליקוזילציה או disulphide. מרחביות-דף, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה, אור לייזר רב זווית פיזור הן טכניקות נפוצות מנוצל כדי להעריך את איכות חלבון רקומביננטי. הספרייה חלבון הוא הבחין על גבי שקופיות epoxysilane ואז ומאוחסנים ב-20 ° C לשימוש ארוך טווח. ריכוז חלבון מעל 0.4 מ”ג/מ”ל מומלצים עבור פרוטוקול המתואר להלן. לכן, נמוך-ביטוי חלבונים עשויה לדרוש צעד ריכוז לפני הדפסת דוגמת ואחסון. למרות זאת, יתרון הראשי של טכניקה זו הוא נפח קטן של החלבון הנדרש (μg 50 של חלבון מספיקה לבצע > מסכי 2,000), לצד צריכת חלבון שאילתה מינימלי (20-25 μg לכל מסך כפילויות). באמצעות פרוטוקול הציוד שמתואר כאן, בתנאי ספריות זמינים, ניתן להפיק תוצאות השאילתה בודדים חלבונים תוך יום עבודה אחד.

האתגר העיקרי באיתור אינטראקציות חלבון בסביבה חוץ-תאית נובע טבעם כאופייני חלש או ארעית, שמונע את זיהוי באמצעות מתודולוגיות הנפוצות ביותר. הגדלת ובצמא מחייב את מאוד משפר את הרגישות לגילוי חלבון חלש אינטראקציות^9,10,11. מבוסס על עיקרון זה פיתחנו שיטה כדי multimerize את החלבונים שאילתה (המבוטא פיוז’ן Fc) באמצעות חלבון חרוזים מצופים A^4,5. כדי למנוע כל איון פוטנציאלי של החלבון שאילתה על-ידי תיוג אקראי, אנחנו במקום תווית לא רלוונטית האנושי בנוגדנים G עם Cy5 ולהוסיף אותו יחד עם החלבון השאילתה החרוזים חלבון א’, וכך למנוע פריטים בשל הבניין ישירה של לצבוע את החלבון עניין. בהתחשב את הזיקות micromolar של מספר זוגות קולטן שיתוף, מתחמי multivalent מאוד לשפר את האות לרעש יחס, לעומת Fc-fusion שאילתה חלבונים מוקרן חלבונים מסיסים⁴.

לסיכום, המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את הכנת שקופיות microarray המכיל ספריה חלבון חוץ-תאית קיימים עבור זיהוי של קולטן-ליגנד אינטראקציות. אנו בודקים את השלבים עבור שקופית הדפסה, ואחריו פרוטוקול להקרנה של חלבון עניין נגד הספרייה חלבון חוץ-תאית. יתר על כן, אנו מתארים שיטה לגילוי משופרת של ePPIs מבוסס על גרגרי להשגת ובצמא מוגברת של החלבון שנבחנה. חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה microarray המתוארים כאן מייצג גישה מהירה, עמיד ויעיל של ההקרנה וכן זיהוי אפי הרומן עם יחס חיובי-false נמוכה, על ידי ניצול מיקרוגרם בלבד, כמויות החלבון השאילתה תחת החקירה. טכנולוגיה זו הניע מחקרים רבים שסיפקו תובנות רלוונטיות תאיים לא מוכרת, איתות המסלולים למגוון רחב של קולטנים^12,13, לרבות נגיפי immunoregulators¹⁴, יכול להיות מנוצל כדי לבטל את orphanize חלבון חוץ-תאית בכל עניין.