Hier beschrijven we een protocol om het uiten van eiwitten in protoplasten met behulp van PEG-gemedieerde transformatie methode. De methode biedt eenvoudige uitdrukking van proteïnen van belang, en efficiënte opsporing van eiwit lokalisatie en het importproces voor verschillende experimentele omstandigheden in vivo.
De chloroplast is een essentiële organel dat verantwoordelijk is voor diverse cellulaire processen in planten, zoals fotosynthese en de productie van veel secundaire metabolieten en lipiden. Chloroplasten vereist een groot aantal proteïnen voor deze verschillende fysiologische processen. Meer dan zijn 95% van chloroplast eiwitten kern-gecodeerd en geïmporteerd in de chloroplasten van het cytosol na vertaling op cytosolische ribosomen. De juiste invoer of richten van deze kern-gecodeerde chloroplast proteïnen tot chloroplasten is dus essentieel voor de goede werking van chloroplasten, alsmede de plant cel. Nucleus-gecodeerde chloroplast eiwitten bevatten signaal reeksen voor specifieke targeting tot chloroplasten. Moleculaire machines gelokaliseerd op de chloroplast of cytosol deze signalen herkennen en uitvoeren van het importproces. Voor het onderzoek naar de mechanismen van eiwitten importeren of het gericht op chloroplasten in vivo, ontwikkelden we een snelle, efficiënte protoplast gebaseerde methode voor het analyseren van eiwitten invoer in chloroplasten of Arabidopsis. In deze methode gebruiken we geïsoleerd van blad weefsels van Arabidopsisprotoplasten. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van protoplasten te onderzoeken het mechanisme waardoor eiwitten worden geïmporteerd in chloroplasten.
De chloroplast is een van de belangrijkste organellen in planten. Een van de belangrijkste functies van chloroplasten is fotosynthese1uitvoeren. Chloroplasten zijn ook uitvoeren van vele andere biochemische reacties voor de productie van vetzuren, aminozuren en nucleotiden tal secundaire metabolieten1,2. Voor al deze reacties vereist chloroplasten een groot aantal verschillende soorten eiwitten. Het genoom chloroplast bevat echter slechts ongeveer 100 genen3,4. Daarom moeten de chloroplasten de meerderheid van hun eiwitten uit het cytosol importeren. In feite, werden meeste chloroplast eiwitten aangetoond te worden geïmporteerd uit het cytosol na vertaling4,5,6. Plantaardige cellen vereisen specifieke mechanismen eiwitten importeren van het cytosol naar chloroplasten. Echter, hoewel deze eiwitten importeren mechanismen zijn onderzocht voor de afgelopen decennia, wij nog steeds volledig begrijpen niet hen op moleculair niveau. Hier, voorzien wij een gedetailleerde methode voor de voorbereiding van protoplasten en exogenously uiten van genen in protoplasten. Deze methode zou kunnen zijn waardevol voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan eiwit invoer in chloroplasten in detail.
Eiwit importeren kan worden bestudeerd met behulp van veel verschillende benaderingen. Een van deze methoden impliceert het gebruik van een in vitro eiwit invoer systeem7,8. Met behulp van deze aanpak, in vitro-vertaalde proteïne-precursors worden geïncubeerd met gezuiverde chloroplasten in vitroen eiwitten importeren wordt geanalyseerd door SDS-PAGE gevolgd door westelijke vlekkenanalyse. Het voordeel van deze aanpak is dat elke stap van eiwitten importeren in chloroplasten in detail bestudeerd kan worden. Dus, deze methode heeft wijd gebruikt te bepalen van de componenten van de import van de moleculaire machine van eiwit en te ontleden opeenvolgingsinformatie voor doorvoer peptides. Meer recentelijk, een andere benadering met betrekking tot het gebruik van protoplasten uit blad weefsels werd ontwikkeld en het is geworden wijd gebruikt om te studeren eiwit invoer in chloroplasten9,10. Het voordeel van deze aanpak is dat protoplasten een cellulaire omgeving die dichter bij die van de onbeschadigde cellen dan de in vitro -systeem. Dus, de protoplast-systeem stelt ons in staat om aan te pakken veel extra aspecten van dit proces, zoals de bijbehorende cytosolische gebeurtenissen en hoe de specificiteit van targeting signalen wordt bepaald. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van protoplasten aan studie eiwit invoer in chloroplasten.
Wij voorzien een gedetailleerd protocol in het gebruik van protoplasten van Arabidopsis aan studie eiwit invoer in chloroplasten. Deze methode is krachtig voor het onderzoeken van het importproces eiwit. Deze eenvoudige, veelzijdige techniek is nuttig voor de behandeling van de gerichtheid van de beoogde lading eiwitten tot chloroplasten. Met deze methode worden protoplasten bereid met blad weefsels van Arabidopsis11,12 , die kan worden verkrege…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd uitgevoerd met de ondersteuning van het coöperatieve onderzoeksprogramma voor landbouw wetenschap en technologische ontwikkeling (Project nr. PJ010953012018), Rural Development Administration en de subsidie van de National Research Foundation (Korea) gefinancierd door het ministerie van wetenschap en ICT (nr. 2016R1E1A1A02922014), Republiek Korea.
GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |