Macropinocitosis, a gran escala absorción de líquido no específico, es importante en muchas áreas de la biología clínica incluyendo Inmunología, infección, cáncer y enfermedades neurodegenerativas. Aquí, las técnicas existentes se han adaptado para permitir la resolución de alto rendimiento, sola celda medición de macropinocitosis en la macropinocitosis modelo organismo discoideum de Dictyostelium utilizando citometría de flujo.
A gran escala no específico líquida absorción por macropinocitosis es importante para la proliferación de ciertas células de cáncer, antígeno muestreo, invasión de la célula huésped y la propagación de las enfermedades neurodegenerativas. Las cepas de laboratorio comúnmente usado de la ameba Dictyostelium discoideum tienen tasas de absorción de líquido extremadamente altas cuando se cultiva en medio nutritivo, más del 90% de los cuales es por macropinocitosis. Además, muchos de los componentes conocidos de macropinocitosis mamíferos también están presentes, lo que es un sistema modelo excelente para estudiar la macropinocitosis. Aquí, la técnica estándar para medir líquido internalizada usando dextranos fluorescentes como etiqueta se adapta a un formato de placa de 96 pocillos, con las muestras analizadas por citometría de flujo utilizando un accesorio de toma de muestras de alto rendimiento (HTS).
Las células se alimentan no templables al dextrano fluorescente para un periodo determinado de tiempo, lavado por inmersión en buffer helada y separadas con azida de sodio 5 mM, que también se detiene la exocitosis. Las células en cada pozo se analizan por citometría de flujo. El método también puede ser adaptado para medir la absorción de la membrana y fagocitosis de perlas fluorescentes o bacterias.
Este método fue diseñado para permitir la medición de la absorción de líquido por Dictyostelium de una manera eficiente de alto rendimiento, trabajo y recursos. Permite la comparación simultánea de múltiples cepas (por ejemplo , mutantes de octavos de final de un gen) y condiciones (por ejemplo células en diferentes medios de comunicación o tratados con diferentes concentraciones de inhibidor) en paralelo y simplifica el tiempo-cursos.
A gran escala no específico líquida absorción por macropinocitosis es importante en varios contextos biológicos1, incluyendo muestreo de antígeno por inmune las células2, entrada del patógeno en host células3, cáncer de la célula proliferación4 y la propagación de prion enfermedades5. En mamíferos y en las células de Dictyostelium , actina6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (aunque la naturaleza exacta de los lípidos es diferente entre los dos11), activado Ras12,13y activado Rac14,15 son importantes para la eficiente absorción del líquido por macropinocitosis, aunque quedan muchas preguntas sin respuesta acerca de cómo es el parche macropinocytic formado, organizado y eventualmente interiorizada. Descubrir las proteínas más importantes de macropinocitosis y determinación de cómo son importantes en los diversos contextos biológicos, le dará una comprensión más completa de macropinocitosis y permitir desarrollo de tratamientos específicos para una variedad de condiciones.
Dictyostelium es un sistema modelo ideal para estudiar la macropinocitosis. El alto nivel de macropinocitosis constitutiva en cepas de laboratorio estándar significa que la absorción flúida está sobre el 90% debido a la macropinocitosis6. Esto permite macropinocitosis a medir únicamente mediante la determinación de absorción de líquidos, a diferencia de las células mamíferas donde es mucho menor la proporción de absorción de líquido debido a la macropinocitosis. Macropinocitosis está tan bien definida y fácilmente visualizados12 en este sistema de igual manera ofrece ventajas distintivas para la investigación de base componentes conservados de la macropinosome frente a otros sistemas que puede haber múltiples señales reglamentarias 16 , 17.
La técnica estándar usada para medir la macropinocitosis por células de mamífero consiste en fijar las células después de la pulsación con dextrano durante un período corto de tiempo seguido por microscopia para determinar el área de una célula que está ocupado por vesículas de dextrano-positivo18. Esta técnica sin embargo no da cuenta de la posibilidad de macropinosomes contracción al entrar en la célula, que se ha divulgado en Dictyostelium19y sólo tiene en cuenta planos individuales de la célula, lo que significa el volumen internalizado no está claro. Una técnica alternativa, de contar el número de macropinosomes internalizado en un momento dado, tiene los mismo inconvenientes20. Uso de Dictyostelium evita estos problemas; sin embargo, las técnicas existentes para medir la absorción flúida en Dictyostelium son relativamente cantidad de mano de obra, usando un grande de las células y dextrano21. Las células se agitan a alta densidad en muestras retiradas en varios puntos del tiempo para la determinación de la fluorescencia internalizada usando un Fluorímetro y dextranos fluorescentes. Células preparadas de esta manera se pueden analizar mediante citometría de flujo para obtener unicelular, en lugar de a nivel de población, resolución22, aunque esto sigue siendo bajo rendimiento.
Aquí, la técnica estándar para medir líquido internalizada usando dextranos fluorescentes como etiqueta se adapta a un formato de placa de 96 pocillos, con las muestras analizadas por citometría de flujo utilizando un accesorio de toma de muestras de alto rendimiento (HTS). Las células se alimentan no templables al dextrano fluorescente para un periodo determinado de tiempo, lavado por inmersión en buffer helada y separadas con azida de sodio 5 mM, que también se detiene la exocitosis. Las células en cada pozo se analizan por citometría de flujo. Este método fue diseñado para superar las limitaciones de los métodos anteriores y permitir comparación simultánea de la absorción de líquido de un gran número de cepas y condiciones utilizando menos recursos y reduciendo la mano de obra involucrada.
Mientras que otros métodos para evaluar la absorción de líquidos son bajo rendimiento, lavado las células en situ y el uso de azida de sodio para separar las células es los pasos críticos en este método, que permiten alto rendimiento medición de macropinocitosis, absorción de la membrana, o fagocitosis por Dictyostelium. Como las células se unen a una superficie y el medio no es, pueden ser colocadas mientras que el medio que les rodea en primer lugar se lanza apagado y luego cambió por inmersión en solución tampón y lanzados apagado otra vez. Azida sódica, que agota el ATP celular y despolarizan la membrana30, entonces se utiliza para separar las células y también previene la exocitosis sin afectar la viabilidad de la célula24.
Mientras que mediante citometría de flujo para medir la macropinocitosis por Dictyostelium da una medición muy precisa de la absorción de líquido muy rápidamente, para establecer la razón por qué una cepa particular o condición ha alterado la absorción flúida, más investigación utilizando la microscopia es necesario24. También cabe señalar que, en algunos casos, resultados previamente publicados demuestran una diferencia en la absorción de líquido por cepas mutantes cultivadas en una superficie (como en este caso), o en la agitación de la suspensión (como en el protocolo estándar)31. Este método puede significar que, en casos raros, defectos de absorción de fluido aparente falten. Además, al medir fagocitosis, pueden utilizarse sólo bajas concentraciones de partículas. La máxima tasa de fagocitosis que se puede determinar con esta técnica es muy inferior a la máxima real, aunque todavía es posible medir diferencias relevantes en fagocitosis entre cepas y condiciones24. Para determinar la máxima tasa de fagocitosis, se medirá la absorción en sacudiendo la suspensión por un protocolo alternativo27. Las células que han fagocitado los granos han aumentado dispersión lateral, por lo que esto debe corregirse para en consecuencia cuando se configura el citómetro de flujo.
Citometría de flujo puede utilizarse para medir la absorción de líquido en células de mamíferos32, sin embargo la mayor proporción de líquido fase absorción por otras vías endocíticas que visto en Dictyostelium es una preocupación. Además, las células son típicamente separadas usando tripsina a 37 ° C, permitiendo que más progresión endocíticas de dextrano internalizada. Azida sódica helada no causa macrófagos que separan de una superficie (Williams, inédito observación), lo que esta técnica no es aplicable a células de mamífero sin más optimización.
Medida de alto rendimiento de macropinocitosis tiene el potencial para ser utilizado para la pantalla de forma rápida y barata para los efectos de los inhibidores, mutación genética o knockdown de genes en células de Dictyostelium . Mutantes siempre deben ser comparados con su padre directo solamente. Si el lector no tiene ninguna preferencia previa por Dictyostelium cepa, cepas no axénicos DdB como NC4 son más “tipo salvaje” que axénicos y pueden manipularse efectivamente axénicos de las cepas33. De lo contrario, son el axénicos Ax2 cepas cepas con el menor genoma duplicaciones34, mientras que muchas variedades de Ax4 son nocauts A Talin y deben ser evitado si es posible23. Más las cepas previamente publicadas pueden solicitarse desde el centro de Stock de Dicty35.
Esta técnica permite mayores posibilidades de investigación que antes era posible sobre los efectos de diferentes condiciones, inhibidores y mutaciones de macropinocitosis de Dictyostelium.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a la Medical Research Council UK para la base del financiamiento (U105115237) a RRK.
LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | – | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
Sodium azide | VWR | 103694M | |
Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
SM agar | Formedium | SMACFG | |
0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |