טיהור של Trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (Diethylaminoethyl-תאית עמודות)
Summary
שיטה זו של הפרדה trypanosome הדם תלויה שלהם תשלום משטח שלילי פחות מאשר בתרבית של תאי דם. דם נגוע להציב, שטופלו על עמודת מחליף אניון. שיטה זו, הכי מתאים אבחון של מחלת השינה, מספקת טפילים מטוהרים לחקירות חיסוניות, ביולוגיים, ביוכימיים, פרמצבטיקה וביולוגיה מולקולרית.
Abstract
שיטה זו מאפשרת ההפרדה של trypanosomes, טפילים אחראי על בעלי חיים ועל האדם מחלת השינה (כובע), של דם נגוע. השיטה הטובה ביותר לאבחנה של השלב הראשון הכובע, יתר על כן שיטה זו טיהור טפיל היתרים סרולוגית ומחקר חקירות.
כובע נגרמת על ידי זבובים ששודרו Trypanosoma brucei gambiense , ט rhodesiense ב. Trypanosomes קשורים הם הסוכנים סיבתי של trypanosomiasis בעלי חיים. Trypanosome זיהוי חיוני עבור כובע אבחון, טיפול ומעקב. בטכניקה המתוארת כאן הטכניקה זיהוי הטפיל רגיש ביותר, המותאמים לתנאי שדה לאבחון של gambiense נולד ב- ט’ הכובע, יכול להסתיים בתוך שעה אחת. הדם הוא שכבות על גבי עמודת מחליף אניון (DEAE תאית) בעבר מותאם pH 8, מאגר • תנאי נוסף. תאי הדם טעונים מאוד שלילית הם הספוחה אל העמודה ואילו trypanosomes טעונים שלילית פחות עוברים. Trypanosomes שנאספו מגורען על ידי צנטריפוגה, שנצפה על ידי מיקרוסקופ. יתר על כן, טפילים מוכנות ללא נזק תאי תוך שמירה על infectivity שלהם.
Trypanosomes מטוהרים נדרשים לבדיקת אימונולוגי; הם משמשים trypanolysis וזמינותו, תקן הזהב בסרולוגיה כובע. טפילים מוכתם מנוצלים ב המבחן התלכדות כרטיס (CATT) עבור השדה סרולוגיה. אנטיגנים של trypanosomes מטוהרים, כגון גליקופרוטאין השטח משתנה, exoantigens, משמשים גם immunoassays שונים. ההליך המתואר כאן מיועד trypanosomes אפריקה; כתוצאה מכך, כרומטוגרפיה תנאים צריך להיות מותאם לכל זן trypanosome, באופן כללי יותר, הדם של כל מיני יונקים המארח.
מרתק פתוגנים אלו בקלות מטוהרים וזמין לשימוש בהביוכימי, מולקולרית ותא ביולוגיה ללימודי כולל תרבות משותפת עם התאים המארחים לחקור קשרי גומלין מארח-טפיל ברמה של קולטני ממברנה איתות, ג’ין ביטוי; סמים בדיקות חוץ גופית בתוך; חקירה של ג’ין מחיקה, מוטציה או ביטוי על תהליכי חילוף החומרים, cytoskeletal להן והישרדות טפיל.
Introduction
השיטה המובאת המתוארים כאן מאפשר ההפרדה של trypanosomes, טפילים אחראי על בעלי חיים ועל האדם מחלת השינה (כובע), מהדם. השיטה הטובה ביותר לאבחנה של השלב הראשון הכובע, יתר על כן שיטה זו טיהור טפיל היתרי החקירה סרולוגית ומחקר חזקים.
כובע נגרמת על ידי זבובים ששודרו Trypanosoma brucei gambiense ו- rhodesiense נולד ב- טי1. אלה טפילים protozoan הכפל extracellularly למחזור הדם, הלימפה, וכן נוזלים interstitial בשלב הראשון של המחלה (שלב hemolymphatic). השלב השני (שלב meningoencephalitic) מתחיל כאשר טפילים לחצות את מחסום הדם מוח; סימנים נוירולוגיים, כולל הפרעת שינה, אשר נתן את השם “מחלת השינה” למחלה זו, אופייניים זה שלב2. קשורים trypanosomes (evansi ט congolense ט, ט vivax, brucei נולד ב- ט) הסוכנים סיבתי של חיה אפריקאית trypanosomosis (AAT)3.
ארגון הבריאות העולמי (WHO) שמטרתו לחסל את הכובע כבעיה בריאות הציבור על ידי 2020 להפסיק שידור על-ידי 20304. המבוא האחרונות של בדיקות אבחון מהירה כולל אבחון משופר סרולוגית1,4,5. פותחו מספר בדיקות אבחון מולקולרי אך תפקידם בתוכנית האבחון השדה טרם בוטלה הוקמה5. הם משמשים לזיהוי תת המינים של brucei קבוצה של trypanosomiasis טיפוסיות הנגרמת על ידי טפילים אחראי בבעלי חיים trypanosomosis6.
זיהוי הטפיל חיוני עבור אבחון, טיפול ומעקב, סרולוגיה יכול לתת תוצאות שליליות כוזב חיובי ו- false למרבה הצער1. בהתבוננות ישירה microscopical protists hemoflagellate אלה קשה במקרים הכובע הנגרמות על-ידי gambiense נולד ב- ט’, (יותר מ- 95% מהמקרים) כמו parasitemias נמוכה גם הכלל, ואילו כובע נגרם על-ידי rhodesiense נולד ב- ט’, גדול מספר טפילים נמצאים לעתים קרובות הדם. טכניקות ריכוז שונות היו בשימוש, כגון ירידה עבה, צינור קפילרי צנטריפוגה (CTC), אבל ההפרדה של טפילי הדם לפי עמודה של אניון-מחליף (DEAE תאית) ואחריו צנטריפוגה, התבוננות מיקרוסקופית גלולה, היא השיטה הכי רגיש (בסביבות 50 טפילים/מ”ל של דם יכולה להתגלות)1,7. כתוצאה מכך, הטיהור של trypanosomes בשיטה זו אניון-מחליפי (DEAE תאית) הוא הטוב ביותר, נכון להיום, שיטת הפניה עבור להמחיש ובידוד טפילי הדם לאבחון את הכובע. בתנאי שדה, עמודה מיני DEAE תאית שימש בהצלחה והנחה מספר שיפורים יש תצפית microscopical7,8.
שיטת ההפרדה trypanosome מדם, המתוארים להלן, תלוי תשלום משטח טפיל, פחות שלילית יותר בתרבית של תאי דם9. מעניין, שיטה זו פותחה לפני 50 שנה, בשנת 1968 על ידי ד ר שילה לנהאם, ונותרה תקן הזהב זיהוי, הכנת trypanosomes למחזור הדם. זה מהיר, לשחזור עבור salivarian trypanosomes ממגוון רחב של יונקים, המתיר את האבחנה של שני בעלי חיים ועל האדם trypanosomiasis10.
כדי להשיג טפילים חי, מטוהרים, דם נגוע נוסף על גבי עמודת מחליף אניון. תנאים כרומטוגרפיה (בעיקר ה-pH, כוח יונית של מאגרי/מדיה) צריך להיות מותאם לכל מין trypanosome, באופן כללי יותר, כל שילוב של בתרבית של תאי דם, trypanosomes10. • תנאי מאגר מכוון בדיוק pH 8 trypanosomes ביותר אפריקאי10. שיטה זו מיטיבה את הריכוז של טפילים נמצאו בדם של חולים, כי parasitemias יכול להיות נמוך מדי יזוהו על-ידי התבוננות מיקרוסקופית לבד, והוא גם מאפשר חקירות מעבדה. עבודה עם trypanosomes טרי מבודד, על דם של חיות נגועות, באמצעות טכניקה זו, היא יותר רלוונטי לחקירה שונים מאשר מחקרים עם טפילים תרבותי בתנאים axenic במעבדה לתקופה בלתי מוגבלת.
קשרי גומלין מארח-טפיל נלמדים בצורה הטובה ביותר עם הטפיל מדביק המארח הטבעי שלו, לכן, ט musculi, טפיל מאתר טבעי, אשר הוא נציג של trypanosomes חוץ-תאית, יש יתרונות רבים כמו זיהום מאתר כרוך חיות מעבדה קטנה לא דורשת תנאי רמת (BSL) בטיחות חומרים מסוכנים. ט musculi לא הורג עכברים immunocompetent, בניגוד מינים רבים אחרים Trypanosoma , כולל האדם פתוגנים. ט musculi לא יחוסלו בעכברים תא T-מקופח, parasitemias ניתן להגדיל אצל עכברים נגועים על ידי שינוי צריכת מוצרי מזון, חומרי מזון11. הטפיל הזה שמחליש את התגובה החיסונית זיהומים שיתוף עם אחרים פתוגנים12. ט musculi של עכברים נגועים הבדלים נספח תרבותי musculi ט, לדוגמה, הביטוי של קולטני ממברנה Fc אבוד בתרבויות axenic ט musculi , לעומת טפילים מכל עכברים נגועים13 , 14. גורמים מופרש Excreted (ESF) הם גם איכותית באופן כמותי פחות בא לידי ביטוי בתרבויות axenic trypanosome ו שונים בין זנים שבודדו אזורים אנדמיים15. ESF הם אנטיגנים הראשון להיות מוצגת בפני המערכת החיסונית המארח, אז יש תפקיד חשוב במארח הראשונית התגובה החיסונית16.
אצל בעלי חיים נגועים השפעול לחקירות מעבדה, פרוטוקול זה מקלה על ניסויים מספר רב יותר של טפילים, צמצום מספר עכברים הנדרש במיוחד כאשר באמצעות בעלי חיים immunosuppressed. Glycoproteins משטח variant (VSGs) הנמצאים בשימוש במבחן התלכדות כרטיס עבור Trypanosomiasis (CATT) בעת ההקרנה ההמונית וגופם מטוהר עדיין מן trypanosomes אשר מופצים בחולדות. שני מהירה בדיקות אבחון (קלטות עטופה בנפרד) זמינים כעת לשימוש בשטח, עדיין משתמשים מקור דגם זיהומיות של יליד VSGs, לא במבחנה תרבותי trypanosomes1,4, 5. ההתקדמות במחקר של trypanosome אימונולוגיה, ביולוגיה יש שניתנו לשיירה מאז אלה טפילים תאית מטוהר DEAE ניתן להשיג בקלות בכמויות גדולות ממחשבים מארחים טבעי או השפעול נגוע, ובחודש מסוים, מכרסמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trypanosomes מטוהרים מייצגים אמצעי רב עוצמה ללמוד אימונולוגיה, ביוכימיה, הסלולר וביולוגיה מולקולרית. מרחבים פתוחים של נתונים ותוצאות הושגו מן trypanosomes, אשר סייעה ואז לקבל מידע אחרים התאים האיקריוטים30. Trypanosomes הם גם הנושא של מחקר חשוב ומעניין כי הם פיתחו מנגנונים רבים זה מאפשר להם לשר?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל חברי UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD אוניברסיטת דה בורדו. מחקר זה נתמך על ידי מימון פנימי של האוניברסיטה של בורדו ויוצקים תמיכה את ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, ומן האגודה le développement de la en רשרש parasitologie et médecine tropicale, דה שירות coopération et d’action התרבות דה l’Ambassade דה פראנס א’ בנגי (Centrafrique).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
Referencias
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?. Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host’s parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
