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Inmunología y contagio

실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 뎅 그 열 바이러스 RNA를 측정

Published: November 01, 2018
doi:
10.3791/58407
, , , , ,
1Department of Microbiology and Infection Control,Osaka Medical College

Summary

반전 녹음 방송 (실시간 정량)와 함께 하는 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 분석은 RNA 바이러스 감염의 수준을 측정 하 널리 사용 되었습니다. 여기는 직접 실시간 정량 분석 결과, 뎅기열 바이러스를 포함 하 여 여러 RNA 바이러스의 정량화에 대 한 개발 하는 RNA 정화 단계를 필요 하지 않는 선물이.

Abstract

현재, 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기술은 감도, 특이성, 때문에 필수 도구 탐지 및 정량화 연구 실험실, 바이러스 성 게놈의 뿐만 아니라 분자 진단 및 편의입니다. 그러나, 대부분의 경우, 정량 PCR (정량) 분석 결과 일반적으로 검출 하기 위하여 이용 바이러스 감염 PCR 단계 전에 바이러스 성 핵 산 정화에 의존 하고있다. 이 연구에서는 형광 기반 반전 녹음 방송 (실시간 정량) 정량 분석 결과 개발 처리 버퍼와 원스텝 RT-PCR 시 약의 결합을 통해 전체 프로세스, 바이러스 감염의 문화 상쾌한의 수확을 실시간 탐지까지 셀 바이러스 성 RNA 정화 없이 수행할 수 있습니다. 설립된 프로토콜 90 분 이내 뎅기열 바이러스 (DENV)의 넓은 범위 RNA 농도의 정량화를 수 있습니다. 또한, 항 바이러스 대리인의 평가를 직접 실시간 정량 분석 결과의 적응성을 이전에 보고 된 DENV 억제 물, mycophenolic 산 (MPA)를 사용 하 여 생체 외에서 실험에 의해 증명 됩니다. 또한, 다른 RNA 바이러스, 황열병 바이러스 (YFV), (MeV), 홍 역 바이러스, Chikungunya 바이러스 (CHIKV) 등 같은 프로토콜 정량 직접 RT-Pcr에 의해 측정할 수 있습니다. 따라서,이 보고서에 설명 된 직접 실시간 정량 분석 결과 더 높은 처리량 검열 연구 및 임상 진단을 위한 유망한 플랫폼으로 개발 될 것입니다 간단 하 고 빠른 방법에 있는 RNA 바이러스 복제를 모니터링 하기 위한 유용 합니다.

Introduction

속 Flavivirus Flaviviridae 가족의 구성 이상 70 덮여, 모기와 진드기에 의해 전송 되는 양성 가닥 RNA 바이러스. 중요 한 것은, 인간은 종종 flavivirus 감염 출혈 열과 뇌염1등 심각한 임상 질병, 이끌어 낸다. 사실, Zika 바이러스 (ZIKV)는 flavivirus의 최근 발발 아메리카에 걸쳐 폭발적으로 확산 하고있다 고 microcephaly2,3를 포함 한 신경 합병증과 관련 된 것으로 표시 되었습니다. Flaviviruses, 그러므로, 현대 사회에 중요 한 임상 및 경제 영향을 미칠.

중요 한 flavivirus 뎅기열 바이러스 (DENV), 세계의 열 대와 아열대 지역에서 광범위 하 게 배포 모기 품 어진 바이러스입니다. DENV는 Aedes 모기, Aedes albopictus 등 Aedes aegypti, 결과 뎅기열 발생4의 글로벌 확산에 의해 전송 됩니다. 세계 보건 기구 (WHO)에서 뎅기열 병 세 가지 범주로 분류 하는 현재,: 뎅기열 경고 표시, 경고 표시, 및 심한 뎅기열4뎅기열 없이. DENV (DENV-1-4)의 1 차 감염 4 serotypes 중 하나는 종종 있지만 무 증상 또는 자기 제한, 역학 연구 다른 serotypes의 2 차 감염의 더 심각한 형태의 뎅기열 위험을 증가 나타났습니다. 그것은 비-DENV 감염의 항 체-종속 기능 향상 협조할 또는 2 차 감염으로 발생 한 심한 뎅기열의 잠재적인 메커니즘으로 제안 되었습니다 1 차 감염 기간 동안 생산 하는 항 체를 subneutralizing. 그러나, 특정 항 바이러스 약은 DENV 감염5가능 하다.

DENV에 대 한 항 바이러스 제의 개발에 대 한 루틴 및 높은 처리량 설정 의무가 있는 강력한 분석 양적 바이러스 복제를 탐지 하기 위한 필수적입니다. 전통적으로, 전염 성 바이러스 및 바이러스 항 원 검출을 위한 면역학 분석 (예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 [일 라]) 측정을 위한 생물학적 분석 (예를 들어, 패 분석 결과) DENV를 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 복제 생체 외에서 그리고 vivo에서6,7. 그러나,이 분석 실험은 수시로 힘 드는 고 필요를 위해 몇 일 샘플의 많은 수의 처리를 방해 하. 이와 관련, 실시간 정량은 DENV 감염을 탐지 하기 위한 신뢰할 수 있는 분석 결과: 그것은 특정, 민감한, 그리고 상대적으로 빠른7. 또한, 실시간 정량 Pcr 기술은 높은 처리량 형식에 더 많은 이점이 있다. 그럼에도 불구 하 고, RNA 바이러스에 대 한 RT-PCR의 일반적인 절차는 수집 된 샘플에서 바이러스 성 핵 산의 복구를 요구 한다. 다양 한 추출 방법 실시간 정량 pcr 채택 될 수 있다, 비록 정화 바이러스 성 RNA를 여러 단계 여전히 필요 합니다. 또한, 실시간 정량 Pcr 분석 실험은 일반적으로 비싼 스핀 열 또는 유해 유기 용 매, 그로 인하여 더 성가신 만드는 준비 과정 필요 합니다. 실패 또는 샘플 간의 교차 오염을 방지 하는 것입니다 바이러스 성 게놈의 성공적인 정량화에 대 한 중요 한 요소, 덜 힘들고 시간이 걸리는 방법 이므로, 실시간 정량 Pcr에 적용할 경우에 특히 높은 처리량 형식입니다.

여기, 우리는 바이러스 성 RNA 정화를 포함 하지 않는 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 DENV RNA를 측정 하기 위한 간단한 실시간 정량 Pcr 절차 보고. 이 최적화 된 실시간 정량 Pcr 프로토콜은 두 단계 구성: 처리 버퍼와 한 단계 ii) 실시간 정량 실시간 PCR 장비에서 DENV에 감염 된 세포 배양의 상쾌한의 i) 외피. 따라서, 표면에 뜨는 문화 DENV RNA 90 분 (그림 1) 내에서 검색할 수 있습니다. 우리는 또한 다른 RNA 바이러스 감염을 직접 실시간 정량 Pcr의 응용 프로그램을 설명합니다.

Protocol

1. RNA 표준의 DNA 템플렛 준비 준비는 PCR 혼합 (50 μ, 표 1의 총 볼륨)를 사용 하 여 DENV-2 뉴 기니 C를 포함 하는 플라스 미드 DNA 벡터 (NGC, 승인 번호: AF038403.1) 3′ 되지 않은 지역 (3′ UTR)8 및 뇌관 (T7-DENV 3 ‘UTR Fwd 및 DENV 3′ UTR Rvs) 0.2 mL 튜브에서로 표 2에서 설명합니다.참고:이 단계는 깨끗 한 후드 (또는) 클린 룸에서 실시 하는 amplicon 관련 제품의 오염을 피하기 위하여. PCR 증폭 t 7의 cDNA 순서-융합 DENV 3′ UTR는 thermocycler, 다음과 같은 조건을 사용 하 여에서: 30 사이클 (98 ° C 10의 s, 55 ° C 5에 대 한 s, 및 5 위한 72 ° C s). 0.1에서 10 kilobase 쌍 (kbp)에 이르기까지 DNA 분자 사다리 젤 로드 염료 및 부하에 1 %agarose 젤 x 6의 10 μ와 PCR 반응 혼합. 긴 파장의 자외선 DNA 시각화 방법과 젤 이미징 시스템을 사용 하 여 아래 PCR 제품 (479 기본적인 쌍 [bp])를 시각화 합니다. 깨끗 한 메스를 사용 하 여 DNA 밴드를 잘라. DNA 정제 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 DNA를 추출 합니다.참고:이 정화 단계는 깨끗 한 후드 밖에 서 수행할 수 있습니다 하지만 다음 DENV RNA 표준 합성 단계에서 주요 문제는 RNase 오염을 피하기 위하여 과정에서 깨끗 한 환경 유지에 필수적 이다. 젤 조각 무게 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 젤 조각 100 밀리 그램 당 캡처 버퍼의 100 μ를 추가 합니다. 5-15 분 동안 60 ° C에 외피에 의해 젤을 디졸브. 컬렉션 튜브 DNA 정화 열을 조립 하 고 정화 열에 녹아 샘플의 600 μ를 전송. 30 s를 통해 흐름 삭제 16000 x g 에서 원심. 샘플 볼륨 600 μ 보다 큰 경우, 첫 번째 스핀 후 DNA 정화 열 샘플의 나머지 부분을 적용 하 고이 단계를 반복. DNA 정화 열 버퍼 세척의 500 μ를 적용 합니다. 30 16000 x g 에서 원심 분리기 s. 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 열을 놓습니다. 차입 버퍼의 50 μ를 추가 하 고 1 분 동안 실내 온도에 열의 품 어. DNA elute 1 분 최대 속도로 원심. 260에 DNA의 광학 밀도 측정 eluted 샘플의 3 μ를 사용 하 여 분 광 광도 계에 nm. 차입 버퍼의 동일한 볼륨을 사용 하 여 빈으로.참고: DNA 템플릿을 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 사용까지. 2. DENV 3′ UTR RNA 표준의 합성 참고: 유지 ribonuclease (RNase)-무료 환경으로 다음 단계를 수행 수. 시의 설정 nuclease 무료 pipets, 팁, 그리고 튜브를 사용 하 여 깨끗 한 후드 안에 수행 되어야 한다. 생체 외에서 전송 (IVT) 반응 (20 μ의 총 볼륨)의 100 혼합 T7 RNA 발기인 순서 융합 DENV 3′ UTR DNA에서에서 서식 파일 (1.6 단계) 표 3에 설명 된 대로 0.2 mL PCR 튜브의 ng. 2 h thermocycler에서 37 ° C에 혼합물을 품 어. 1 μ DNase의 IVT 반응에 추가 하 고 15 분 동안 37 ° C에는 부 화를 계속. 정화는 생체 외에서 RNA는 RNA 정화 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 복사할. RNase 무료 H2O의 80 μ와 350 추가 1% β-mercaptoethanol을 포함 하 여 캡처 버퍼의 μ. 100% 에탄올의 250 μ IVT 반응에 추가 하 고 pipetting으로 잘 섞는다. 컬렉션 튜브와 RNA 정화 열을 조립 하 고 정화 열에 RNA 샘플을 전송. 8, 000에서 원심 g 15 s와 흐름을 통해 삭제에 대 한 x. RNA 정화 열 세척 버퍼의 500 μ를 적용 하 고 2 분 동안 8000 x g 에서 원심. 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 열을 놓습니다. RNase 무료 H2O의 50 μ를 추가 하 고 1 분 동안 실내 온도에 열의 품 어. RNA elute 1 분 최대 속도로 원심. 260에 RNA의 광학 밀도 측정 eluted 샘플의 3 μ를 사용 하 여 분 광 광도에 nm. H2O의 동일한 볼륨을 사용 하 여 빈으로. 합성된 DENV 3′ UTR RNA의 복사본 수를 결정 합니다. 1 RNA DENV 3′ UTR의 ng (462 기초, 그림 2)은 109 부 x 4.05. -80 ° C에서 RNA 표준 사용까지 저장 합니다. 3. 실시간 정량에 대 한 바이러스 샘플의 처리 참고: 단계 3.1-3.3 생물 안전 캐비닛 안에 수행할 수 있습니다. 특히, biosafety 수준 2 (또는 더 높은) 환경에 전염 성 바이러스를 포함 하는 문화 상쾌한의 처리를 실시 해야 합니다. 처리 버퍼 및 가수분해 nuclease 무료 공화국의 1 μ의 믹스 199 μ 직렬 합성된 DENV 3′ UTR RNA (2.6 단계)에서 희석 1:10 5 x 109 RNA 표준 사용 하 여 5 x 103 복사본/μ를 세포 배양 매체 (예를 들어, 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 항생제 [DMEM/10% FBS] 보충 DMEM) 40 단위/mL RNase 억제제를 포함 하. 버퍼/가수분해 K 솔루션 (3.1 단계)에서 처리의 5 μ와 DENV에 감염 된 세포와 DENV 3′ UTR RNA 표준의 문화 상쾌한의 믹스 5 μ 8 튜브 PCR 스트립 또는 PCR 96 잘 접시를 사용 하 여. 비-템플릿 컨트롤 (NTC), 혼합 세포 배양 매체의 5 μ (즉, 바이러스는 포함) 처리 버퍼/가수분해 K 솔루션의 5 μ로. 간단히 원심 분리 후 thermocycler 다음 조건을 사용 하 여 샘플을 품 어: (25 ° C 10 분 및 5 분 동안 75 ° C)의 1 주기.참고: 가공된 샘플 경우 실시간 PCR 분석은 같은 날에 4 ° C에서 보관할 수 있습니다. 장기 저장을 위한 샘플-80 ° c.에 저장 한다 4. 실시간 PCR 분석 참고: 그것은 좋습니다 amplicon 관련 제품 또는 RNase의 오염을 최소화 하기 위해 깨끗 한 후드 내부 단계 4.1-4.4 하. 원스텝 RT-PCR 시 약 (자료 테이블)와 실시간 정량 마스터 믹스 (RNase 무료) 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 준비 DENV 3′ UTR 전용 프라이 머를 사용 하 여 fluorogenic 프로브 (표 1). 각 구성 요소 (표 4) 샘플, 표준 RNA와 NTC 반응 등의 총 수의 11% 이상에 따르면의 볼륨을 확장할. 96-잘 실시간 PCR 플레이트 (자료 테이블)에 사용 하 우물에 마스터 믹스의 aliquot 8 μ. 짧게 처리 샘플, 표준 DENV 3′ UTR RNA와 NTC를 포함 하 여 (단계 3.4)에서 원심 고 96 잘 실시간 PCR 플레이트의 각 음에 샘플의 2 μ를 추가 합니다. 광학 투명 접착 필름으로 PCR 접시를 봉인. 짧게 원심 200 x g 공기 방울을 제거 하는 접시. 실시간 PCR 악기에 접시를 놓고 다음과 같은 조건을 사용 하 여 접시를 주기: RT의 1 주기 단계 (10 분 동안 25 ° C), 중 합 효소 활성화 단계 (2 분 동안 95 ° C)의 1 개 주기 증폭 단계의 40 주기 (95 ° C 10 s와 30에 대 한 60 ° C에 대 한 s [단일 데이터 취득이이 단계에서]). 실시간 PCR 관련 소프트웨어를 사용 하 여 샘플에서 DENV RNA의 복사본 수를 결정 합니다. 설치 창에서 알 수 없는 샘플으로 분석 하는 반응의 우물을 할당 합니다. 순차적으로 희석된 DENV 3’ UTR RNA의 표준 으로 잘 할당 하 고 각 잘에서 RNA 표준 예상된 복사본 수를 입력 (예를 들어, 5 x 103 복사본/μ RNA 표준 솔루션의 사용 하는 경우 입력 5000). NTC에 대 한 부정적인 제어 로 우물을 지정 합니다. 분석 창에서 분석 을 클릭 하 고 생성 된 표준 곡선의 상관 계수 (R2)에 해당 하거나 0.98 보다 큰 있는지 확인 합니다. 일반적으로 사용 하는 기본 Ct 설정 (임계값: 자동, 초기 시작 주기: 자동, 기준선 끝 주기: 자동) 분석에 대 한.참고: 알 수 없는 샘플 복사본 수는 개별 반응의 주기 (Ct) 임계값에 따라 자동으로 계산 됩니다. 각 샘플의 계산 된 복사 번호 RNA 복사본 당 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응 으로 간주 됩니다 (예를 들어, 12,345 는 알 수 없는 샘플에 표시 된 경우, 즉 DENV RNA의 12,345 사본에 반응)입니다.

Representative Results

실시간 정량 분석에 의해 DENV RNA의 정량화에 대 한 동일한 뇌관에 의해 검출 될 수 있다 알려진된 복사본 수의 표준 설정, 필수. 이 프로토콜, 462 뉴클레오티드 긴 RNA는 3 ‘UTR DENV-2 NGC 스트레인의 시퀀스는 생체 외에서 T7 RNA에서 복사할 발기인-융합 DENV-2 3′ 포함 된 UTR DNA 템플렛, PCR에 의해 증폭 되 고 정화 된 했다 (그림 2A 와 2B). 때 DENV RNA (5 x 109 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응에서 5 x 102 복사본)에서 직접 실시간 정량 분석을 복종 되었다 표준의 직렬 10 희석 사용 하 여 3′ UTR 특정 뇌관 및는 fluorogenic 프로브9, 선형 좋은 상관 계수 곡선 (R2 = 0.98726) (그림 2C)를 취득 했다. 다음, 직접 실시간 정량 분석 결과이 바이러스에 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 DENV 계량에 적용 되었습니다. DENV-2 (싱가포르 격리 EDEN2 329510), C6/36 모기 세포에 전파 고 패 분석 결과 BHK 21 셀11을 사용 하 여 적정, 직렬 (8 x 106 80 플 라크 형성 단위 [PFU] /mL)에서 희석 되었다. DENV 샘플 다음 가수분해 K virions를 deproteinize에 포함 된 처리 버퍼의 동등한 양으로 취급 되었고 DENV 3′ UTR RNA 시퀀스를 대상으로 직접 실시간 정량 분석 결과를 받게. 다시, 좋은 상관 관계 (R2 = 0.99981)과 사이 DENV 감염 titer Ct, 형광 신호 배경 위에 기하급수적으로 상승 하는 지점 수 간주 되는 주기 수 (그림 3A) 얻은. 알려진된 감염 titers와 DENV의 직렬 희석에서 생성 된 Ct 값으로 표준 곡선에 표시 했다 때 체 외에서 복사할 3′ UTR 80 PFU/mL (8 x 103 크거나 8 x 106 에서 얻은 음모의 모든 RNA 10-2 PFU 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응에서 x 8) 표준 RNA에 들어서는 그의 범위 안에 (5 x 103 5 x 109 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응, 그림 3B에서 복사), DENV 감염의 다양 한 샘플을 나타내는 titers 같은 시간에이 직접 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 병렬 실험에서 실시간 정량 분석에 의해 버퍼 또는 바이러스 성 RNA의 검출에 가수분해 K 치료 처리의 효과 조사 했다. 하지만 로그 희석 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) RT-정량 (PBS 가진 바이러스 샘플의 1:1 희석)와 25 ° C 10 분 및 5 분 동안 75 ° C의 외피 elicited 전에 혼자와 DENV 샘플 (8 x 106 8 x 102 PFU/mL)의 치료는 회귀 곡선 (그림 3C, 검은 선), 그리고 PBS 처리 하 여 얻은 평균 Ct 값 2.6-3.2 주기 지연 버퍼/가수분해 K 치료 (그림 3C, 점선)를 처리 하 여 얻은 Ct에 비해. 또한, 바이러스 (8 x 102 x 10-1 PFU 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응 당 [8] PFU/mL)의 높은 희석이 PBS 치료 (그림 3C)와 함께 검색 되지 않을. 처리 버퍼 처리 (그림 3C, 회색 선) 동안 가수분해 K의 부재에서 비슷한 회귀 생성 했다; 그러나, 증폭에 지연 (0.1-0.8 사이클) 여전히 상대적인 가수분해 K (그림 3C, 점선)를 포함 하는 처리 반응 관찰 되었다. 이러한 데이터, 테스트 조건 중 치료 성분 K 함께 처리 버퍼 DENV 샘플의 RT 정량 분석 결과의 감도 향상을 나타냅니다. 직접 실시간 정량 분석 결과 더 DENV에 대 한 항 바이러스 대리인 확인에 그것의 적용에 대 한 평가 했다. Mycophenolic 산 (MPA), 이식, 계통이 사용 되는 inosine monophosphate 효소의 nonnucleoside 억제제12,13 생체 외에서DENV 억제에 보고 되었습니다. 연구 분석 결과 기존의 플 라크 또는 DENV 감염12,13에 MPA의 억제 효과 설명 하는 바이러스 항 원 검출을 교류 cytometry 분석 결과 고용, 비록 현재에서 연구, 직접 실시간 정량 MPA의 항 바이러스 활동을 평가에 적용 됩니다. 헬러 세포, 했다 시드 5 x 104 셀/잘 24-잘 접시의 조밀도에 감염 이전에 1 일, DENV-2 1 h 1의 나를 노출 했다 하 고, 세척, 후 경작 DMEM/10% FBS와 50-0.016 μ g/mL의 MPA ( 또는 0.1% 디 메 틸 sulfoxide [DMSO]). 표면에 뜨는 문화는 감염 후 3 일 수집 DENV 3′ UTR 특정 뇌관과 형광 프로브를 사용 하 여 직접 실시간 정량 분석 결과를 복종 하 고. 그림 4 에 감염 된 세포를 체 외에서 복사할 3′ UTR RNA 표준에 의해 결정 했다 MPA의 농도 증가 함께 치료의 문화 supernatants (반응) 당 DENV RNA 복사본을 보여 줍니다. 50 μ g/mL (156 μ M)의 치료와 함께 MPA, DMSO 처리 제어 문화의 99.87 ± 0.02% 감소 (그림 4) 관찰 되었다. 중요 한 것은, 그림 4 에 표시 된 데이터에 의해 결정 하는 MPA의 IC50 (50% 금지 농도) 값은 0.79 μ 값과 유사한 보고 이전12,13. 이 결과 따라서이 직접 실시간 정량 분석 결과 DENV 감염에 항 바이러스 대리인의 억제 효과 평가 하기 위한 유용 하 고 신뢰할 수 있는 방법 임을 나타냅니다. 마지막으로, 다른 RNA 바이러스를 직접 실시간 정량 분석 결과의 응용 프로그램은 테스트 되었습니다. YFV-17 D-특정 뇌관 및는 fluorogenic로14를 프로브 변형의 황열병 바이러스 (YFV) 17 D 백신 (Flaviviridae) 했다 Vero 세포에서 증폭 되어 고 BHK 21 셀에 적정, 주식 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 직접 높였을 때 표 1에 설명 된 바이러스 titers Ct 값 사이 좋은 직접적인 상관 관계와 함께 표준 곡선 생성 될 수 바이러스 주식의 10 직렬 희석으로 (3.2 x 105 3.2 PFU/mL, 그림 5A). 마찬가지로, Chikungunya 바이러스 (CHIKV, Togaviridae)의 실시간 정량 분석을 직접 로스 스트레인 재고 Vero 세포에서 증폭 되어 졌고 CHIKV 전용 프라이 머를 사용 하 여 fluorogenic 프로브15 (표 1), BHK 21 셀에 적정 전염 성 titers 사이 좋은 회귀 했다 (4.4 x 108 4.4 x 103 PFU/mL)와 Ct 값 (그림 5B). 이것은 또한 전파 되었으며 Vero 세포로, 이전에 사용 하 여 적정 했다 홍 역 바이러스 (백만 전자 볼트, Paramyxoviridae)의 직렬 희석 (8 x 102 8 x 10-2 PFU/mL, 그림 5C)의 검출을 위한 경우 보고 된 뇌관 및 fluorogenic 조사16 (표 1) 이 데이터는 다양 한 RNA 바이러스의 정량적 검출에 대 한 직접적인 실시간 정량 분석 결과의 적응성을 보여 줍니다. 그림 1: 직접 실시간 정량 분석 결과의 워크플로. DENV에 감염 된 세포의 문화 상쾌한 바이러스 성 RNA (샘플 처리 단계) 출시 K 성분을 포함 하는 처리 버퍼 처리 됩니다. 가공된 샘플 다음 단계 RT-PCR 시 약을 혼합 하 고 DENV 3′ UTR 특정 뇌관과 fluorogenic 프로브를 사용 하 여 실시간 PCR 분석 결과를 받게. 각 샘플에서 발견 하는 바이러스 성 RNA의 수준을 순차적으로 희석된 한 표준에 의해 결정 될 수 있다 생체 외에서 사용 하 여 복사할 DENV RNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2: RNA DENV 3′ UTR에 의해 생성 된 표준 곡선. (A) 표준 RNA 포함 3′ UTR의 DENV 2 NGC 베낀 생체 외에서 PCR 파편을 융합 하는 시퀀스 T7 RNA 발기인에서 했다. (B) 정화 DENV 3’ UTR RNA (250 ng) 1 %agarose 젤 (오른쪽 차선)에 가시화 했다. 왼쪽된 차선 RNA 전기 이동 법에 대 한 분자량 마커를 보여줍니다. DENV 3 ‘UTR RNA 표준 K 성분을 포함 된 처리 버퍼 처리 되었고 원스텝 실시간 정량 Pcr 시 약 및 DENV 3를 사용 하 여 실시간 PCR 분석 대상이’ UTR 특정 뇌관 및 fluorogenic 프로브 세트의의 (C) A 로그 희석 평균 Ct 값 (n = 3)에서 각각 희석 3′ UTR RNA의 예상된 수량에 대 한 표시 했다 (5 x 102 RNA를 5 x 109 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응에서 복사). R2 는 상관 계수 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: 직접 실시간 정량으로 바이러스 재고가 DENV RNA의 정량화. C6/36 세포에서 생산 하는 (A) 높은 titer DENV-2 주식은 10 배 희석 직렬 (8 x 106 8 x 101 PFU/mL) DMEM/10% FBS와 RNase 억제제를 포함 하 고 DENV 3′ UTR 전용 프라이 머를 사용 하 여 직접 실시간 정량 분석 결과를 받게 /probe입니다. (B) Ct 값 로그 희석 DENV 재고 (원)의 실시간 정량 Pcr에 의해 얻은 문자 3′ UTR RNA (삼각형)의 표준 곡선에 표시 했다 생체 외에서. 8 x 106 PFU/mL 주식 직접 실시간 정량 분석 결과에서 사용 하 여 실시간 정량 Pcr 반응 8 x 103 10 μ에 바이러스의 PFU에 해당합니다. (C)이이 패널 처리 버퍼 및 바이러스 성 RNA의 검출에 가수분해 K 치료의 효과 보여줍니다. DENV 희석 주식 (8 x 106 8 x 102 PFU/mL) 가수분해 K (흰색 원), 버퍼 혼자 (회색 원), PBS (검은 동그라미)를 처리 하 고 다음 직접 대상이 포함 된 처리 버퍼의 동등한 양으로 알을 품는 실시간 정량 Pcr의 시험 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: 직접 실시간 정량 Pcr에 의해 MPA의 억제 효과의 평가. HeLa 세포는 DENV-2 1, MPA, DENV (또는 0.1 %DMSO)의 이전에 보고 된 억제제의 농도 증가의 교양의 나에 감염 되었다. 3 일 후 감염, 감염 된 세포의 문화 supernatants 수집 되었고 DENV 3′ UTR 전용 프라이 머/프로브를 사용 하 여 직접 실시간 정량 분석 결과를 받게. 바이러스 성 RNA의 복사본 수에 의해 결정 되었다 DENV 3′ UTR RNA 표준 베낀된 체 외. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5: 다른 RNA 바이러스의 검출에 대 한 직접적인 실시간 정량의 응용 프로그램. 순차적으로 희석된 바이러스 주식 (A) YFV, (B) CHIKV, 및 (C) 백만 전자 볼트의 PCR 뇌관을 사용 하 여 직접 실시간 정량 Pcr 분석 실험을 복종 되었다 그리고 fluorogenic 그들의 각각 바이러스 성 RNA 시퀀스에 특정 프로브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 목적 이름 시퀀스 (5′-3′) 참고 T7 발기인 융합 DENV-2 3’UTR cDNA 증폭 T7 DENV 3′ UTR Fwd TAA 전술 GAC TCA CTA 태그 GGc gaa tTA GAA GGC AAA 법 AAC ATG AAA 기울임꼴, T7 발기인; 소문자, 공백; 굵게, DENV-2 NGC 뉴클레오티드 10,270-10,292 Rvs DENV 3′ UTR AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGC DENV-2 NGC 뉴클레오티드 10,723-10,703 DENV의 실시간 정량 분석 DENV-2 3′ UTR F 아 그 GAC 태그 AGG 온 개 그 개 그 ACC C 참조 9 DENV-2 3′ UTR R GGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA 안내 프로브 2 덴-2-4 6FAM-AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA 아 그 ACC-TAMRA YFV의 실시간 정량 분석 YFV NS5 F GAA CAG TGA TCA GGA ACC CTC TCT 참고 14 YFV NS5 R GGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G YFV NS5 프로브 6FAM-CTA CGT GTC TGG AGC CCG CAG CAA T-TAMRA CHIKV의 실시간 정량 분석 CHIK E1 F TCG ACG CGC CCT CTT TAA 기준 15 CHIK E1 R ATC GAA TGC ACC GCA CAC T CHIK E1 P 6FAM-ACC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-TAMRA MeV의 실시간 정량 분석 MeV N F TGG 고양이 CTG AAC TCG GTA TCA C 참고 16 MeV N R TGT CCT CAG 태그 문신 GCA TTG CAA MeV N P 6FAM-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-TAMRA 표 1: Oligonucleotide 뇌관 및 fluorogenic 프로브 시퀀스가이 연구에 사용 된. 구성 요소 사진 농도 볼륨 (μ) 최종 농도 PrimeSTAR 최대 프리 믹스 2 x 25 1 x T7 DENV 3′ UTR Fwd 1 Μ M 10 200 nM Rvs DENV 3′ UTR 1 Μ M 10 200 nM pEU/DENV 3 ‘ UTR 1 ng/μ 1 20 세/μ H2O nuclease 무료 4 총 50 표 2: PCR의 구성 요소는 DENV 3′ UTR 템플릿 DNA의 준비에 대 한 믹스. 구성 요소 사진 농도 볼륨 (μ) 최종 농도 T7 시퀀스 융합 DENV 3′ UTR DNA 템플렛 (변수) x 100 반응 당 ng ATP 솔루션 75 m m 2 7.5 m m CTP 솔루션 75 m m 2 7.5 m m GTP 솔루션 75 m m 2 7.5 m m UTP 솔루션 75 m m 2 7.5 m m 반응 버퍼 10 배 2 1 x T7 효소 혼합 2 재조합 RNase 억제제 40 단위/μ 1 2 단위/μ H2O nuclease 무료 7-x 총 20 표 3:는 IVT의 구성 요소는 표준 DENV 3′ UTR RNA 합성에 대 한 믹스. 구성 요소 사진 농도 볼륨 (μ) 실시간 정량 Pcr 반응에서 최종 농도 iTaq 범용 프로브 반응 혼합 2 x 5.00 1 x iScript 고급 역전사 40 x 0.25 100 반응 당 ng 뇌관/프로브 믹스 DENV-2 3′ UTR F: 3 Μ M 1.00 300 nM DENV-2 3’ UTR 연구: 3 Μ M 300 nM 프로브 2 덴-2-4: 2 μ M 200 nM H2O nuclease 무료 1.75 부분합 8.00 표 4: DENV RNA의 실시간 RT 정량 분석에 대 한 마스터 믹스의 구성 요소. 유의 처리 DENV 샘플 (또는 표준 RNA)의 2 μ 8 μ 마스터 믹스 (반응 당 10 μ의 총)에 추가 되어야 한다.

Discussion

오늘, 형광 기반 실시간 PCR에 의해 바이러스 성 핵 산 검출의 감도 속도7인 병원 성 인간의 바이러스의 분자 진단에 대 한 황금 표준 되고있다. 이것은 특히 뎅기열17등 급성 전염병의 초기 단계에서 바이러스 감염을 확인 중요 합니다. 또한, 기본 DNEV 연구의 분야에서 실시간 정량 분석 결과 생체 외에서 문화, DENV의 복제 생물학과 항 바이러스 억제제의 발견에 대 한 이해로 이어질 것입니다 바이러스 복제를 모니터링 하기 위한 필수적인 도구입니다. 이 연구에서는 형광 기반 실시간 PCR 분석 결과 더 개발 되었다 처리 버퍼와 원스텝 RT-PCR 시 약의 조합에 의해 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 DENV RNA 정화 없이 실시간 정량으로 측정할 수 있게 되었다 바이러스 성 RNA 게놈입니다. 패 분석 결과, ELISA, 등 기존의 실시간 정량 고용 RNA 정화6,7, 바이러스 복제를 감지 하는 일상적인 분석 실험에 비해 실시간 정량 분석 결과의 간단한 프로토콜의 시간 큰 감소 귀착되 고 DENV RNA를 측정 하는 데 필요한 단계입니다. 유전 자료의 손실과 오염 최소화에 이점이 중요 한 기능 이기도 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 깨끗 한 후드의 사용 IVT (2.1 단계)의 설정 및 amplicon 관련 제품 또는 RNase의 교차 오염을 피하기 위해 실시간 정량 (단계 4.1-4.4) 반응에 필수적입니다 주목 해야한다. 그것은 또한 표면에 뜨는, 전염 성 바이러스는 biosafety 내각 (단계 3.3) 실험실 감염의 위험을 줄이기 위해 내부를 포함 하 여 문화를 처리 하기 위해 중요 한.

직접 실시간 정량 분석 결과의 또 다른 중요성은 다양 한 바이러스 성 RNA 복사본 또는 샘플의 농도 희석 하지 않고 동시에 분석할 수 있습니다. 순차적으로 희석된 DENV 3′ UTR RNA 표준 사용 되었다 때 직접 실시간 정량 Pcr 프로토콜 선형 표준 곡선 7 배나 통해 생산과 정량화 하한값은 500 RNA 사본 (그림 2). 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 DENV, 8 x 103 10 μ에서 8 x 10-2 PFU 바이러스의 검출에 대 한 실시간 정량 3′ UTR RNA 표준, DENV의 범위 내에서 되었고 낮은 검출 한계 (8 x 10-2 PFU) 11를 포함 하도록 계산 400 ± 7,077 RNA 복사본 (그림 3B). 메모, 여러 flavivirus 연구18,,1920에서 보고의 바이러스 감염 titer (즉, PFU) DENV 샘플에서 바이러스 성 RNA 복사본의 더 큰 비율 또한이 연구에서 관찰 되었다. 이 크게 결함 (즉, 비 전염 성)의 존재 인 것으로 간주 됩니다 바이러스 또는 감염 및 죽은 세포에서 출시 무료 바이러스 성 RNA. 비록이 연구에서 얻은 RNA 복사본: PFU의 비율 (1.1 x 105 105 RNA 복사본/PFU x 1.3) (3 로그 1에서 비율 범위)21,20이전에 표시 된 데이터와 일치,이 있을 수 있습니다 바이러스 긴장, 셀, 또는 고용 문화 조건에 차이에 기인 합니다. 불일치에 대 한 또 다른 가능성이 설명, RNA 정화 프로세스가 여기에 설명 된 직접 실시간 정량 분석 결과에서 포함 되었다, 이후 문화 상쾌한에 더 DENV RNA 검출 될 수 바이러스의 손실 없이 실시간 PCR 분석은 유전 재료입니다.

직접 실시간 정량의 단순 96 잘 접시 등 다 잘 형식에서 샘플의 많은 수를 처리 하는 능력을 향상 시킵니다. 따라서,이 속성 안티 DENV 약물의 발견에 대 한 높은 처리량 검열 연구를 직접 실시간 정량 분석 결과의 미래 응용 프로그램을 지원 합니다. 실제로,이 보고서에서 안티 DENV 억제제, MPA의 유효성 검사에 대 한 직접적인 실시간 정량 분석 결과의 적용, 검사 및 결과 나타났다는 직접 실시간 정량 분석 결과 (그림 4)에 의해 얻은 MPA의 IC50 값 비교 상 패 분석 결과12,13를 사용 하 여 이전 연구에서 보고. 이 직접 실시간 정량 적절 하 게 항 바이러스 대리인의 억제 효과 평가 하기 위한 유용한 분석 결과 이며, 약물 연구를 미래에 심사에 채택 될 수 있는 방법을 보여 줍니다.

이 연구에서는 시도 다른 RNA 바이러스의 검출에 직접 실시간 정량 Pcr을 적용 되었다. 다른 3 개의 RNA 바이러스 (YFV, CHIKV, 및 백만 전자 볼트)의 10 희석 다른 속으로 분류 될 때 그림 5에서 같이 (Flaviviridae, Togaviridae, 그리고 Paramyxoviridae, 각각)를 사용 하 여 시험 되었다 이전 보고 뇌관 및 fluorogenic 프로브 각각 바이러스 성 RNA 시퀀스에 특정 합니다. 좋은 수천 감염 titers Ct 값 직접 실시간 정량 Pcr 분석 실험에 의해 얻은 했다 그리고 상관 관계 했다 4-6 선형 크기 순서. 이 직접 실시간 정량 Pcr 프로토콜은 단순히 바이러스 특정 뇌관을 변경 하 여 다양 한 종류의 RNA 바이러스에 fluorogenic 조사 건의 한다.

그럼에도 불구 하 고, 검출 감도이 연구 (그림 5)에서 테스트 바이러스 중 다양 합니다. 대상 바이러스 RNA의 검출 향상 시킬 수 있는 프로토콜의 한 수정 뇌관/프로브 시퀀스의 새로운 집합을 사용 하도록 해야 합니다. 또한, 성공적인 직접 실시간 정량 분석 결과 대 한 중요 한 단계는 샘플 단계 (단계 3.1-3.4)를 처리 하는 동안 바이러스 성 게놈의 효율적인 출시 될 생각 이다. 이 비 싸여 바이러스 같은 안정적인 바이러스의 정량적 검출을 위한 특별 한 중요성의 것입니다. 비록 예비 실험, Coxsackievirus b 3로 (CVB3), Picornaviridae에 속하는 비 싸여 RNA 바이러스 앞에서 설명한 CVB3 특정 뇌관 및 형광 프로브22를 사용 하 여 직접 실시간 정량 Pcr 분석 실험을 복종 되었다는 긍정적인 amplicon 신호 높은 titer (1 x 105 PFU/mL) 바이러스 재고와도 감지 되지 않을 수 있습니다. 이 크게 비 싸여 바이러스의 높은 물리적 무결성에 기인 될 여겨진다. 지금까지 핵 산 정화 RNA 릴리스에서 다른 프로토콜을 사용 하는 몇 가지 RNA 바이러스를 검출 하기 위하여 개발 되었다 필요로 하지 않는 일부 RT-PCR 분석 실험 단계23,,2425, 26. 따라서, 잠재적으로 탐지의 감도 증가 대체 (또는 추가) 치료의 높은 온도에서 바이러스 샘플의 보육 등의 사용.

요약 하자면,이 연구에서 개발 된 직접 실시간 정량 Pcr 프로토콜 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 바이러스 성 RNA를 측정 하는 간단 하 고 신속 하지만 신뢰할 수 있는 방법 이었다. 이 단순 직접 실시간 정량 분석 결과 바이러스 복제의 높은 처리량 분석에 대 한 약속을 보유 하 고 짧은 시간에 샘플 수를 처리할 수 있습니다. 또한, 다른 RNA 바이러스를 직접 실시간 정량 Pcr 프로토콜의 응용 프로그램 또한 입증 되었다. 이 방법은, 따라서 해야 합니다는 RNA 바이러스 감염 연구 실험실 설정에서 가능 하 게, 임상 진단에 효율적으로 모니터링 하기 위한 유용한 도구.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자 감사 Subhash G. Vasudevan (듀크-싱가포르 국립 대학 대학원의과 대학, 싱가포르) DENV-2는 YFV에 대 한 EDEN2 3295 및 Shunro Imura (검역 역, 고베) 분리에 대 한 일 백신 긴장. 저자는 또한 그들의 도움에 대 한 학과의 미생물학 및 감염 관리의 회원 들에 게 감사. 이 작품은 MEXT KAKENHI 보조금 번호 JP16737900에 의해 지원 됩니다.

Materials

PrimeSTAR Max DNA Polymerase Takara Bio. Inc R045A Comparable PCR reagent kit can be used.
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific A24811 Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
6x Gel Loading Dye New England BioLabs B7024S Comparable gel loading dye can be used.
2-Log DNA Ladder New England BioLabs N3200 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used.
Gel Scene Tablet Astec GST-33 Comparable gel imaging system can be used.
illustra GFX PCR Purification Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9034-70 Comparable gel extraction kit can be used.
BioSpectrometer Eppendorf 6135000905 Comparable spectrophotometer can be used.
MEGAscrip T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334
TURBO DNase Thermo Fisher Scientific AM2238 Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit.
Recombinant RNase Inhibitor Takara Bio. Inc 2313A 40 units/μL
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Comparable RNA purification kit can be used.
CellAmp Direct RNA Prep Kit Takara Bio. Inc 3733Q
Proteinase K Nacalai Tesque 15679-06 > 600 units/mL. Comparable reagent can be used.
iTaq Universal Probes One-Step Kit Bio-Rad 1725141
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL Thermo Fisher Scientific 4346907 Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube.
StepOnePlus Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific StepOnePlus-01 Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
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Suzuki, Y., Kotoura, M., Yashima, S., Wu, H., Nakano, T., Sano, K. Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (141), e58407, doi:10.3791/58407 (2018).
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