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Inmunología y contagio

Messung der Dengue-Virus RNA im Kultur Überstand der infizierten Zellen durch Echtzeit-Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

Published: November 01, 2018
doi:
10.3791/58407
, , , , ,
1Department of Microbiology and Infection Control,Osaka Medical College

Summary

Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion-Analyse kombiniert mit reversen Transkription (RT-qPCR) wurde weithin zur Messung der RNA-Virusinfektionen. Hier präsentieren wir Ihnen einen direkten RT-qPCR-Assay, erfordern keine RNA Reinigungsstufe, entwickelt für die Quantifizierung von mehreren RNA-Viren, einschließlich Dengue-Virus.

Abstract

Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Technologie ist derzeit ein unverzichtbares Tool für die Erkennung und Quantifizierung von viraler Genome in Forschungslabors sowie für molekulare Diagnostik, wegen seiner Empfindlichkeit, Spezifität, und Komfort. Jedoch in den meisten Fällen die quantitative PCR (qPCR) Assay verwendet in der Regel erkennen Virus-Infektion setzt sich auf die Reinigung der viralen Nukleinsäure vor dem PCR-Schritt. In dieser Studie ist die Fluoreszenz basierende reversen Transkription qPCR (RT-qPCR) Assay durch die Kombination von einem Verarbeitung Puffer und ein One-Step RT-PCR-Reagenz entwickelt, so dass der gesamte Prozess von der Ernte des Überstands Kultur der Virus-infizierten Zellen bis zum Echtzeit-Erkennung kann ohne virale RNA Reinigung durchgeführt werden. Das etablierte Protokoll ermöglicht die Quantifizierung der eine breite Palette von RNA-Konzentrationen von Dengue-Virus (DENV) innerhalb von 90 Minuten. Darüber hinaus zeigt die Anpassungsfähigkeit des direkten RT-qPCR-Assays für die Bewertung eines antiviralen mittels in-vitro- Experiment mit einer zuvor gemeldeten DENV Inhibitor, MPA-Säure (MPA). Darüber hinaus können andere RNA-Viren, einschließlich Gelbfieber-Virus (YFV), Chikungunya-Virus (beiden) und Masern-Virus (MeV), durch direkte RT-qPCR mit gleichem Protokoll quantifiziert werden. Daher eignet sich die direkte RT-qPCR-Assay in diesem Bericht beschriebenen für die Überwachung der RNA-Virus-Replikation in eine einfache und schnelle Weise, die in eine vielversprechende Plattform für eine Hochdurchsatz-Screening-Untersuchung und klinische Diagnose weiterentwickelt wird.

Introduction

Die Gattung Flavivirus der Familie Flaviviridae umfasst mehr als 70 eingehüllt, positiv-Stranded RNA-Viren, die durch Stechmücken und Zecken übertragen werden. Wichtig ist, führt Flavivirus-Infektion beim Menschen oft zu klinischen Erkrankung, z. B. hämorrhagisches Fieber und Enzephalitis1. In der Tat ein Ausbruch der Zika-Virus (ZIKV), ein Flavivirus, explosionsartig auf dem amerikanischen Kontinent ausgebreitet hat und hat gezeigt, dass neurologische Komplikationen, einschließlich Mikrozephalie2,3zugeordnet werden. Flaviviren, haben daher erhebliche klinische und ökonomische Auswirkungen auf die moderne Gesellschaft.

Eine wichtige Flavivirus ist Dengue-Virus (DENV), Moskitos übertragene Viren weit verbreitet in den tropischen und subtropischen Gebieten der Welt. DENV wird durch Aedes -Mücken, einschließlich Aedes Albopictus und Aedes Aegypti, wodurch die globale Ausbreitung von Dengue Ausbrüche4übertragen. Derzeit, die World Health Organisation (WHO) stuft Dengue-Erkrankung als drei Kategorien: Dengue-Fieber ohne Warnzeichen, Dengue-Fieber mit Warnzeichen und schwere Dengue-4. Obwohl Primärinfektion mit einem der vier Serotypen des DENV (DENV-1 bis-4) oft asymptomatisch oder selbstlimitierend, haben epidemiologische Studien gezeigt, dass die Sekundärinfektion der verschiedenen Serotypen das Risiko von schweren Formen von Dengue-Fieber erhöht. Es ist erwähnenswert, dass Antikörper-abhängige Verstärkung der DENV-Infektion durch die nicht- oder subneutralizing Antikörper produziert, während die primäre Infektion wurde vorgeschlagen, als ein möglicher Mechanismus der schwere Dengue-Fieber, die als sekundäre Infektion aufgetreten. Jedoch gibt es keine spezifische antivirale Medikament für DENV Infektion5.

Für die Entwicklung der antiviralen Wirkstoffe gegen DENV sind Routine und robuste Assays, die eine Hochdurchsatz-Einstellung zugänglich sind, wesentlich zur Erkennung von Virusreplikation quantitativ. Konventionell, wurden biologische Assays (z.B. Plaque-Assay) zur Quantifizierung der infektiösen Viren und immunologischen Assays (z. B.Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay [ELISA]) zur Erkennung von viralen Antigenen zur DENV überwachen Replikation in Vitro und in Vivo6,7. Jedoch diese Assays sind oft aufwändig und erfordert mehrere Tage, um zu erreichen, die erschwert des Umgang mit einer großen Anzahl von Proben. RT-qPCR ist in diesem Zusammenhang eine zuverlässige Assays zur Erkennung von DENV-Infektion: Es ist spezifisch, empfindlich und relativ schnelle7. Darüber hinaus verfügt die RT-qPCR-Technik mehr Vorteile im Hochdurchsatz-Format. Dennoch verlangt die typische Vorgehensweise von RT-PCR für RNA-Viren die Rückgewinnung von viralen Nukleinsäuren aus gesammelten Proben. Zwar verschiedene Extraktionsmethoden für RT-qPCR eingesetzt werden können, sind mehrere Schritte erforderlich, um die gereinigten virale RNA zu erhalten. Auch erfordern RT-qPCR-Assays in der Regel teure Spin Spalten oder gefährlichen organischen Lösungsmitteln, wodurch des Vorbereitungsprozess schwerfälliger. Da Misshandlung und/oder Cross-Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden ein entscheidender Faktor für die erfolgreiche Quantifizierung von viralen Genomen ist, ist eine weniger aufwändige und zeitraubende Methode bevorzugt, insbesondere dann, wenn die RT-qPCR auf angewendet werden soll Hochdurchsatz-Format.

Hier berichten wir über ein einfaches RT-qPCR-Verfahren zur Messung der DENV-RNA in eine Kultur Überstand der infizierten Zellen, die keine virale RNA Reinigung mit sich bringt. Dieses optimierte RT-qPCR-Protokoll besteht aus zwei Schritten: (i) die Inkubation von einen Überstand von DENV-infizierte Zellkultur mit Verarbeitung Puffer, und (Ii) One-Step RT-qPCR auf einem Echtzeit-PCR-Instrument. Dementsprechend können DENV RNA in einer Kultur überstand innerhalb von 90 min. (Abbildung 1) erkannt werden. Wir beschreiben auch die Anwendung der direkten RT-qPCR auf andere RNA-Virus-Infektionen.

Protocol

1. Vorbereitung der DNA-Vorlage des RNA-Standards Bereiten Sie eine PCR Mischung (Gesamtvolumen von 50 μL, Tabelle 1) mit einem Plasmid DNA Vektor mit DENV-2-Neu-Guinea C (NGC, Zbl-Nummer: AF038403.1) 3′ unübersetzt Region (3′ UTR)8 und Primer (T7-DENV-3 ‘UTR Fwd und DENV-3′ UTR Rvs) in einem 0,2 mL-Röhrchen als in Tabelle 2beschrieben.Hinweis: Dieser Schritt ist unter eine cleane Motorhaube (oder in einem Reinraum) durchgeführt werden um die Kontamination von Amplikons-bezogenen Produkten zu vermeiden. PCR-verstärken die cDNA von T7 Sequenz verschmolzen DENV 3′ UTR in einem Thermocycler, mit den folgenden Bedingungen: 30 Zyklen (98 ° c für 10 s, 55 ° C für 5 s und 72 ° C für 5 s). Mischen Sie die PCR-Reaktion mit 10 μl 6 x Gel-Loading Dye und laden es auf eine 1 % Agarose-gel mit einem DNA-molekulare Leiter von 0,1 bis 10 Kilobase Paare (Kbp). Visualisieren Sie das PCR-Produkt (479 Basenpaare [bp]) unter langwellige UV-Licht mit einer DNA-Visualisierung-Methode und ein Gel imaging-System. Die DNA-Band mit einem sauberen Skalpell ausgeschnitten. Extrahieren Sie DNA mit Hilfe einen DNA-Reinigung-Kit (Table of Materials).Hinweis: Dieser Reinigungsstufe kann außerhalb der cleane Motorhaube durchgeführt werden, aber es ist wesentlich, zu halten eine saubere Umwelt während des Prozesses RNase Kontamination zu vermeiden, die ein großes Problem in den folgenden Schritten der DENV RNA-standard-Synthese ist. Wiegen Sie das Gel-Slice und fügen Sie 100 μL der Sammlungspuffer pro 100 mg Gel Slice in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch hinzu. Lösen Sie das Gel durch Inkubation bei 60 ° C für 5-15 min. Eine DNA-Reinigung-Spalte mit einem Sammelrohr montieren und 600 μL der gelöste Probe auf die Reinigung Spalte übertragen. Zentrifugieren Sie bei 16.000 X g für 30 s und entsorgen der durchströmten. Wenn das Probenvolumen größer als 600 μL ist, gelten Sie den Rest der Probe für die DNA-Reinigung-Spalte nach der ersten Runde, und wiederholen Sie diesen Schritt. Gelten Sie 500 μl Puffer auf die DNA-Reinigung-Spalte zu waschen. Zentrifuge bei 16.000 X g für 30 s. Legen Sie die Spalte in einen neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 50 μL der Elution Puffer und inkubieren Sie die Spalte bei Raumtemperatur für 1 min. Zentrifugieren Sie mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min um DNA zu eluieren. Messung die optische Dichte der DNA bei 260 nm auf einem Spektrophotometer mit 3 μL der eluierten Probe. Verwenden Sie die gleiche Menge an Elution Puffer als Rohling.Hinweis: Die DNA-Vorlage kann bei-20 ° C bis zum Gebrauch gespeichert werden. 2. Synthese von den DENV 3′ UTR RNA Standard Hinweis: Aufrechterhaltung der Ribonuklease (RNase)-freie Umgebung so weit wie möglich die folgenden Schritte ausführen. Der Aufbau des Reagenz sollte innen eine cleane Motorhaube mit Nuklease-freie Mehrkanalpipette, Tipps und Röhren durchgeführt werden. Mischen Sie die in-vitro- Transkription (IVT) Reaktion (mit einem Gesamtvolumen von 20 μl) mit 100 ng der T7-RNA-Promoter Sequenz verschmolzen DENV 3′ UTR DNA Schablone (aus Schritt 1.6) in einem 0,2 mL PCR-Röhrchen wie in Tabelle 3beschrieben. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C in den Thermocycler für 2 h. Die IVT-Reaktion 1 μL der DNase hinzu und die Inkubation bei 37 ° C für 15 min weiter. Reinigen der in-vitro- transkribierte RNA mit einer RNA-Reinigung-Kit (Table of Materials). Fügen Sie 80 μl RNase-freie H2O und 350 μL der Sammlungspuffer, einschließlich 1 % β-Mercaptoethanol. Die IVT-Reaktion 250 μL von 100 % Ethanol hinzu und mischen Sie es gut durch pipettieren. Eine RNA-Reinigung-Spalte mit einem Sammelrohr montieren und die RNS-Probe auf die Reinigung Spalte übertragen. Zentrifugieren sie bei 8.000 x g für 15 s und entsorgen der durchströmten. Der RNA-Reinigung-Spalte 500 μL waschen Puffers zuweisen und 8.000 x g für 2 min zentrifugieren. Legen Sie die Spalte in einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 50 μL der RNase-freie H2O und inkubieren Sie die Spalte bei Raumtemperatur für 1 min. Zentrifugieren Sie es mit der maximalen Geschwindigkeit für 1 min um die RNA zu eluieren. Messung die optische Dichte der RNA bei 260 nm auf einem Spektrophotometer, mit 3 μL der eluierten Probe. Verwenden Sie die gleiche Menge an H2O als Rohling. Bestimmen Sie die Kopienzahl der synthetisierten DENV 3′ UTR RNA. 1 ng DENV 3′ UTR RNA (462 Basen, Abbildung 2) ist vergleichbar mit 4,05 x 109 Exemplare. Die RNA-Standard bei-80 ° C bis zur Verwendung zu speichern. 3. Bearbeitung von Virusproben für RT-qPCR Hinweis: Schritte 3.1-3.3 sind innerhalb einer biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden. Insbesondere muss Umgang mit der Kultur überstand mit einer ansteckenden Virus unter der Biosafety Level 2 (oder höher) Umgebung durchgeführt werden. Mix-199 μL der Verarbeitung Puffer und 1 μL der Nuklease-freie Proteinase K. Seriell verdünnen die synthetisierte DENV 3′ UTR RNA (aus Schritt 2,6) 01:10, 5 x 109 , 5 x 103 Kopien/μL der RNA Verwendung von standard zu erhalten Zelle Kulturmedium (z. B.DMEM mit 10 % fötalen Rinderserum und Antibiotika [DMEM/10% FBS] ergänzt) enthält 40 Einheiten/mL RNase-Inhibitor. Mix 5 μl des Überstands Kultur DENV-infizierten Zellen und DENV 3′ UTR RNA Standard mit 5 μL der Verarbeitung Puffer/Proteinase K-Lösung (von Schritt 3.1) mit 8-Röhre PCR-Streifen oder eine 96-Well-PCR-Platte. Als ein nicht-Template-Kontrolle (NTC), mischen Sie 5 μL Zellkulturmedium (d. h., kein Virus ist im Preis inbegriffen) mit 5 μL der Verarbeitung Puffer/Proteinase K-Lösung. Nach einer kurzen Zentrifugation inkubieren Sie die Proben in einem Thermocycler mit den folgenden Bedingungen: 1 Zyklus (von 25 ° C für 10 min und 75 ° C für 5 min).Hinweis: Proben können bei 4 ° C gehalten werden, wenn die Echtzeit-PCR-Analyse am selben Tag erfolgt. Für langfristige Lagerung sollte die Proben bei-80 ° c gelagert werden (4) Real-Time PCR-Analyse Hinweis: Es wird empfohlen, Schritte 4.1 – 4.4 im Inneren eine cleane Motorhaube, die Verschmutzung der Amplifikate-bezogenen Produkte oder RNase zu minimieren. Bereiten Sie einen RT-qPCR-master-Mix mit einem One-Step RT-PCR-Reagenz (Table of Materials) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch (RNase-freie) mit DENV 3′ UTR-spezifische Primer und einer Fluorogenic Sonde (Tabelle 1). Skalieren Sie die Lautstärke der einzelnen Komponenten (Tabelle 4) entsprechend 11 % der Gesamtzahl der Proben, einschließlich der standard-RNA und NTC-Reaktionen. Aliquoten 8 μL des master-Mix in den Brunnen in einer 96-Well Echtzeit-PCR-Platte (Table of Materials) verwendet werden. Kurz Zentrifugieren Sie Proben, einschließlich der DENV 3′ UTR RNA Standard und NTC (aus Schritt 3.4) und fügen Sie 2 μL der Proben in jede Vertiefung der 96-Well Real-Time PCR Platte hinzu. Die PCR-Platte mit optisch klaren Klebefilm zu versiegeln. Zentrifugieren Sie kurz die Platte 200 X g um Luftblasen zu entfernen. Die Platte in einem Echtzeit-PCR-Instrument und radeln die Platte mit den folgenden Bedingungen: 1 Zyklus des RT (25 ° C für 10 min), Stufe 1 Zyklus der Polymerase Aktivierung Bühne (95 ° C für 2 min), 40 Zyklen der Verstärkerstufe (95 ° C für 10 s und 60 ° C für 30 s [einheitliche Datenerfassung bei diesem Schritt]). Bestimmen Sie die Kopienzahl des DENV RNA in Proben mit einer Echtzeit-PCR-assoziierten Software. Weisen Sie in das Setup -Fenster nun eine Reaktion, die als unbekannter Proben analysiert werden. Weisen Sie den Brunnen der seriell verdünnten DENV 3’ UTR RNA als Standard und die erwarteten Kopienzahl des RNA-Standard in jede Vertiefung geben (z.B.5 x 103 Kopien/μl RNA-standard-Lösung verwendet, geben Sie 5.000). Weisen Sie den Brunnen als Negativkontrolle für NTC. Klicken Sie im Analyse -Fenster auf analysieren und sicherstellen Sie, dass der Korrelationskoeffizient (R2) von der Standardkurve generiert gleich oder größer als 0,98 ist. Im Allgemeinen verwenden Sie die Standardeinstellungen Ct (Schwelle: Autostart, Grundlinie Zyklus: Auto, Basislinie Ende Zyklus: Auto) für die Analyse.Hinweis: Die Kopienzahl des unbekannten Proben werden automatisch basierend auf die Schwellenwerte Zyklus (Ct) der einzelnen Reaktionen berechnet. Die errechnete Kopienzahl von jeder Probe wird als RNA-Kopien pro 10 μl RT-qPCR Reaktion (z. B., wenn in einer unbekannten Probe 12.345 angegeben wird, dies bedeutet, dass 12.345 Kopien DENV RNA in vorhanden sind die Reaktion).

Representative Results

Für die Quantifizierung von DENV RNA durch RT-qPCR-Analyse ein Standard der bekannte Kopienzahl, die durch die gleichen Primer nachgewiesen werden können eingestellt, ist eine Voraussetzung. In diesem Protokoll, die 462 Nukleotid-lange RNA mit der 3 ‘UTR-Sequenz des DENV-2 NGC Stamm war in Vitro aus der T7-RNA transkribiert Promotor-verschmolzen DENV-2-3′ UTR DNA Schablone, die durch PCR verstärkt und gereinigt worden (Abb. 2A und 2 b). bei einer seriellen 10-divisibel Verdünnung der Norm DENV RNA (von 5 x 109 , 5 x 102 Kopien in einer 10 μl RT-qPCR Reaktion) war eine direkte RT-qPCR-Analyse unterzogen mit 3′ UTR-spezifische Primer und einem Fluorogenic Sonde9, eine lineare Kurve mit einem guten Korrelationskoeffizienten (R2 = 0.98726) erhielt (Abbildung 2). Als nächstes wurde dieser direkten RT-qPCR-Assay angewandt, um die DENV im Kultur Überstand der Virus-infizierten Zellen zu quantifizieren. DENV-2 (Singapur isolieren EDEN2 329510), das in C6/36 Mücke Zellen propagiert und von Plaque-Assay mit BHK-21 Zellen11titriert, wurde seriell (von 8 x 106 bis 80 Plaque Bildung Einheiten [PFU] /mL) verdünnt. DENV Proben wurden dann mit ein gleiches Volumen der Verarbeitung Puffer mit Proteinase K um Virionen deproteinize behandelt und eine direkte RT-qPCR-Assay targeting DENV 3′ UTR RNA-Sequenz. Wiederum eine gute Korrelation (R2 = 0.99981) zwischen den DENV infektiöse Titer und der Ct, erhielt etliche Zyklus gilt der Punkt, wo das Fluoreszenzsignal mit exponentiellen Wachstum über dem Hintergrund steigt (Abbildung 3A). Bei der Ct-Werte generiert aus einer serielle Verdünnung der DENV Aktie mit bekannten infektiöse Titer auf der Standardkurve gemacht mit geplottet wurden transkribiert in-vitro- 3′ UTR RNA, alle Darstellungen erhielt von 8 x 106 bis 80 PFU/mL (8 x 103 , gleich 8 x 10-2 PFU in einer 10 μl RT-qPCR Reaktion) innerhalb des Bereichs dieser standard RNA ausgesetzt waren (5 x 109 , 5 x 103 Kopien in einer 10 μl RT-qPCR Reaktion, Abb. 3 b), darauf hinweist, dass DENV mit einer breiten Palette von infektiösen Proben Titer können zur gleichen Zeit, mit dieser direkten RT-qPCR, analysiert werden. In parallelen Experimenten wurde der Effekt von Puffer oder Proteinase K Behandlung auf den Nachweis von viraler RNA durch RT-qPCR-Analyse untersucht. Obwohl eine Log Verdünnung der Probe DENV (8 x 106 bis 8 x 102 PFU/mL) mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) allein vor RT-qPCR (1:1 Verdünnung der Probe des Virus mit PBS) und eine Inkubation von 25 ° C für 10 min und 75 ° C für 5 min entlockte Behandlung eine Regression-Kurve (Abbildung 3, schwarze Linie) und der Ct-Mittelwerte erzielten die PBS-Behandlung wurden 2,6-3,2 Zyklen verzögert im Vergleich zu den Ct erhalten durch die Verarbeitung Puffer/Proteinase K Behandlung (Abbildung 3, gepunktete Linie). Darüber hinaus konnte die höchsten Verdünnung des Virus (8 x 102 PFU/mL [8 x 10-1 PFU pro 10 μl RT-qPCR Reaktion]) nicht mit dieser PBS-Behandlung (Abbildung 3) nachgewiesen werden. In Ermangelung einer Proteinase K während der Verarbeitung Puffer Behandlung (Abbildung 3, graue Linie) wurde eine ähnliche Regression generiert; jedoch die Verzögerung bei der Verstärkung (0,1 – 0,8 Zyklen) wurde noch im Verhältnis zu der Verarbeitung Reaktion mit Proteinase K (Abbildung 3, gepunktete Linie) beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass unter den Bedingungen getestet, Behandlung der DENV Probe mit Verarbeitung Puffer zusammen mit Proteinase K die Empfindlichkeit des RT-qPCR Assays verbessert. Die direkte RT-qPCR-Assay wurde weiter auf seine Eignung zur Validierung antivirale Wirkstoffe gegen DENV bewertet. MPA-Säure (MPA), ein Nonnucleoside-Inhibitor von Inosin Monophosphate Dehydrogenase, die als ein Immunsuppressivum in der Transplantationsmedizin, dient wurde berichtet, DENV in-vitro-12,13zu hemmen. Obwohl die früheren Studien einen herkömmlichen Plaque-Assay oder ein Flow Cytometry Assay zur Erkennung von viraler Antigenen demonstrieren die hemmende Wirkung von MPA auf DENV Infektion12,13beschäftigt, in der vorliegenden Studie, direkte RT-qPCR war angewendet, um die MPA antivirale Aktivität zu bewerten. HeLa-Zellen, die bei einer Dichte von 5 x 104 Zellen/Brunnen in einer 24-Well-Platte 1 Tag vor der Infektion ausgesät wurde, DENV-2 bei einer MOI von 1 für 1 h ausgesetzt waren und nach dem Waschen, kultiviert mit DMEM/10% FBS MPA (in Anwesenheit von 50 – 0,016 μg/mL (oder 0,1 % Dimethyl Sulfoxid [DMSO]). Überstand die Kultur war 3 Tage nach der Infektion gesammelt und die direkte RT-qPCR-Assay mit DENV 3′ UTR spezifische Primer und eine fluoreszierende Sonde ausgesetzt. Abbildung 4 zeigt die DENV RNA-Kopien (pro Reaktion) in der Kultur-Überstände infizierter Zellen mit steigenden Konzentrationen von MPA, die durch ein in-vitro- transkribiert 3′ UTR RNA Standard ermittelt wurden behandelt. Mit einer Behandlung von 50 μg/mL (156 μM) MPA, eine Reduzierung auf 99.87 ± 0,02 % DMSO behandelt Kontrollkultur beobachtet (Abbildung 4). Wichtiger ist, war der IC50 (50 % hemmende Konzentration) Wert für MPA bestimmt durch die in Abbildung 4 dargestellte Daten 0,79 μM, ähnlich die Werte berichtete zuvor12,13. Dieses Ergebnis zeigt daher, dass diese direkte RT-qPCR-Assay eine nützliche und zuverlässige Methode ist für die hemmende Wirkung von antivirale Wirkstoffe auf DENV-Infektion. Zu guter Letzt wurden die Anwendungen den direkten RT-qPCR-Assay mit anderen RNA-Viren getestet. Wenn ein Vorrat an Gelbfieber-Virus (YFV) 17d Impfstamm (Flaviviridae), das in Vero-Zellen verstärkt und titriert auf BHK-21-Zellen, ausgesetzt war, RT-qPCR mit direkten Sonde YFV-17D-spezifische Primer und eine Fluorogenic14, als in Tabelle 1beschrieben, könnte eine Standardkurve mit gute direkte Korrelation zwischen Virus-Titer und Ct-Werte mit einer 10-divisibel serielle Verdünnung der Virus Aktie generiert werden (3,2 x 105 bis 3,2 PFU/mL, Abb. 5A). Ebenso direkte RT-qPCR Analyse des Chikungunya-Virus (beiden, Togaviridae) Ross Stamm bestand, die in Vero-Zellen verstärkt worden und titriert auf BHK-21-Zellen, mit beiden-spezifische Primer und Fluorogenic Sonde15 (Tabelle 1), gaben eine gute Regression zwischen infektiöse Titer (4,4 x 108 bis 4,4 x 103 PFU/mL) und Ct-Werte (Abb. 5 b). Dies galt auch für den Nachweis einer serielle Verdünnung (8 x 102 bis 8 x 10-2 PFU/mL, Abbildung 5) des Masern-Virus (MeV, Mumpsvirus), das propagiert worden und titriert mit Vero-Zellen, die zuvor mit gemeldete Primern und einer Fluorogenic Sonde16 (Tabelle 1). Diese Daten zeigen die Anpassungsfähigkeit des direkten RT-qPCR-Assays für den quantitativen Nachweis von verschiedenen RNA-Viren. Abbildung 1: Workflow des direkten RT-qPCR-Assays. Der Kultur überstand DENV-infizierten Zellen wird mit einer Verarbeitung Puffer mit Proteinase K um virale RNA (Probe-Verarbeitungsschritt) freizugeben behandelt. Die verarbeiteten Probe dann gemischt mit einem One-Step RT-PCR-Reagenz und die Echtzeit-PCR-Assay mit DENV 3′ UTR-spezifische Primer und Sonde Fluorogenic unterzogen. Die Ebenen der viralen RNA in den jeweiligen Proben erkannt ermittelt werden, durch einen seriell verdünnt Standard mit in-vitro- DENV RNA transkribiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: eine Standardkurve generiert durch DENV 3′ UTR RNA. (A) Standard RNA mit 3′ UTR DENV-2 NGC wurde transkribiert in Vitro aus einem T7-RNA-Promoter Sequenz verschmolzen PCR-Fragment. (B) Purified DENV 3’ UTR RNA (250 ng) wurde auf einem 1 % Agarosegel (rechte Spur) visualisiert. Die linke Spur zeigt den Molekulargewicht Marker für RNA-Elektrophorese. (C) A Log Verdünnung DENV 3 ‘UTR RNA-Standard wurde behandelt mit der Verarbeitung Puffer mit Proteinase K und eine Echtzeit-PCR-Analyse mit einem einstufigen RT-qPCR Reagenz und DENV-3′ UTR-spezifische Primer und ein Fluorogenic Sonde. Die Ct-Mittelwerte (n = 3) erhielt im jeweiligen Verdünnungen wurden aufgetragen gegen die geschätzte Menge der 3′ UTR RNA (5 x 109 , 5 x 102 RNA Kopien in einer 10 μl RT-qPCR-Reaktion). R2 ist der Korrelationskoeffizient. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: die Quantifizierung von DENV RNA Virus vorrätig durch direkte RT-qPCR. (A) die hohe Titer DENV-2 Lager in C6/36 Zellen produziert wurde seriell 10-fach verdünnt (8 x 106 bis 8 x 101 PFU/mL) mit DMEM/10% FBS, enthält einen RNase-Inhibitor und unterliegen der direkten RT-qPCR-Assay mit DENV 3′ UTR-spezifische Primer Websitekonfiguration. (B) Ct-Werte, die durch RT-qPCR Log verdünnt DENV Aktie (Kreise) auf eine Standardkurve der 3′ UTR-RNA (Dreiecke) transkribiert geplottet wurden in-vitro-. Die Verwendung von 8 x 106 PFU/mL Brühe in einem direkten RT-qPCR-Assay entspricht 8 x 103 PFU des Virus in einer 10 μl RT-qPCR Reaktion. (C) dieser Bereich zeigt die Auswirkungen der Verarbeitung Puffer und Proteinase K Behandlungen auf den Nachweis von viraler RNA. DENV verdünnt Lager (8 x 106 bis 8 x 102 PFU/mL) wurde mit einem gleichen Volumen Verarbeitung Puffer mit Proteinase K (weiße Kreise), Verarbeitung Puffer allein (graue Kreise) oder PBS (schwarze Kreise) und dann direkt an die unterzogen inkubiert. RT-qPCR-Assay. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Auswertung der hemmenden Wirkung der MPA durch direkte RT-qPCR. HeLa-Zellen wurden mit DENV-2 bei einem MOI 1 und kultiviert in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von MPA, ein zuvor gemeldeten Inhibitor DENV (oder 0,1 % DMSO) infiziert. Drei Tage nach der Infektion wurden Kultur Überstände der infizierten Zellen gesammelt und die direkte RT-qPCR-Assay mit DENV 3′ UTR-spezifische Primer/Sonden. Die Kopienzahl des viralen RNA wurde durch DENV 3′ UTR RNA standard transkribierten in Vitrobestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: die Anwendung der direkten RT-qPCR zum Nachweis von anderen RNA-Viren. Seriell verdünnten Virus-Aktien (A) YFV, beiden (B) und (C) MeV der direkten RT-qPCR-Assay mit PCR Zündkapseln ausgesetzt waren und Fluorogenic Sonden spezifisch für ihre jeweiligen viralen RNA-Sequenzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Zweck Name Sequenz (5′ – 3′) Hinweis T7-Promoter-verschmolzen DENV-2-3’UTR cDNA Amplification T7-DENV 3′ UTR Fwd TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC Gaa tTA GAA GGC AAA ACT AAC ATG AAA Kursiv, T7-Promotor; Kleinbuchstaben, Abstandhalter; Fett, DENV-2 NGC Nukleotide 10.270-10.292 DENV 3′ UTR Rvs AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGC DENV-2 NGC Nukleotide 10.723-10.703 RT-qPCR Analyse der DENV DENV-2 3′ UTR F AAG GAC TAG AGG TTA GAG GAG ACC C Referenz 9 DENV-2 3′ UTR R GGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA TG Fühler 2 Höhle-2-4 6FAM-AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA AAG ACC-TAMRA RT-qPCR Analyse der YFV YFV NS5 F GAA CAG TGA TCA GGA ACC CTC TCT Referenz 14 YFV NS5 R GGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G YFV NS5 Sonde 6FAM-CTA CGT GTC TGG AGC CCG CAG CAA T-TAMRA RT-qPCR Analyse der beiden CHIK E1 F TCG ACG CGC CCT CTT TAA Referenz 15 CHIK E1 R ATC GAA TGC ACC GCA CAC T CHIK E1 P 6FAM-ACC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-TAMRA RT-qPCR Analyse der MeV MeV N F TGG KATZE CTG AAC TCG GTA TCA C Referenz 16 MeV N R TGT CCT CAG TAG TAT GCA TTG CAA MeV N P 6FAM-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-TAMRA Tabelle 1: Oligonukleotid Primer und Fluorogenic Sonde Sequenzen in dieser Studie verwendet. Komponenten Lager Konzentration Volumen (μL) Endkonzentration PrimeSTAR Max Premix 2 x 25 1 x T7-DENV 3′ UTR Fwd 1 ΜM 10 200 nM DENV 3′ UTR Rvs 1 ΜM 10 200 nM pEU/DENV 3′ UTR 1 ng/μl 1 20 Pg/μL Nuklease-freie H2O 4 Insgesamt 50 Tabelle 2: Komponenten eines PCR Mischung für die Zubereitung von DENV 3′ UTR Schablone DNA. Komponenten Lager Konzentration Volumen (μL) Endkonzentration T7-Sequenz verschmolzen DENV 3′ UTR DNA Schablone (variabel) x 100 ng pro Reaktion ATP-Lösung 75 mM 2 7,5 mM CTP Lösung 75 mM 2 7,5 mM GTP-Lösung 75 mM 2 7,5 mM UTP Lösung 75 mM 2 7,5 mM Reaktion-Puffer 10 x 2 1 x T7-Enzym-Mix 2 Rekombinante RNase-Inhibitor 40 Einheiten/μL 1 2 Einheiten/μL Nuklease-freie H2O 7 – x Insgesamt 20 Tabelle 3: Komponenten einer IVT mischen zur Synthese des DENV 3′ UTR RNA Standards. Komponenten Lager Konzentration Volumen (μL) Endkonzentration in eine RT-qPCR-Reaktion iTaq universal-Sonden Reaktion Mischung 2 x 5,00 1 x iScript erweiterte Reverse Transkriptase 40 x 0,25 100 ng pro Reaktion Primer/Sonden-mix DENV-2 3′ UTR F: 3 ΜM 1.00 300 nM DENV-2 3’ UTR R: 3 ΜM 300 nM Fühler 2 Höhle-2-4: 2 μM 200 nM Nuklease-freie H2O 1.75 Zwischensumme 8,00 Tabelle 4: Komponenten des master-Mix für RT-qPCR Echtzeitanalyse von DENV RNA. Beachten Sie, dass 2 μL des verarbeiteten DENV Probe (oder standard RNA) 8-μl-master-Mix (insgesamt 10 μL pro Reaktion) hinzugefügt werden.

Discussion

Heute gewinnt die virale Nukleinsäure-Nachweis von Leuchtstoff-basierte Echtzeit-PCR ein Goldstandard für die molekulare Diagnostik pathogener menschlichen Viren aufgrund seiner Empfindlichkeit und Schnelligkeit7. Dies ist besonders wichtig für die Bestätigung von Virus-Infektion in der frühen Phase der akuten Infektionskrankheiten wie Dengue-Fieber-17. Auch im Bereich der Grundlagenforschung DNEV ist RT-qPCR-Assay ein unverzichtbares Werkzeug für die Überwachung der Virusreplikation in in-vitro- Kultur, die zu einem Verständnis der Replikation-Biologie der DENV und der Entdeckung von antiviralen Inhibitoren führen wird. In dieser Studie wurde die Leuchtstoff-basierte Echtzeit-PCR-Assay durch eine Kombination von einem Verarbeitung Puffer und ein One-Step RT-PCR-Reagenz weiterentwickelt, DENV RNA im Kultur Überstand der infizierten Zellen ohne Reinigung von RT-qPCR quantifiziert werden konnte Das virale RNA-Genom. Im Vergleich zu Routine-Assays zur Erkennung der Virusreplikation, wie Plaque-Assay, ELISA, oder konventionelle RT-qPCR beschäftigen RNA Reinigung6,7, ein vereinfachtes Protokoll des RT-qPCR Assays ergab eine starke Reduzierung der Zeit und notwendigen Schritte zur DENV RNA zu quantifizieren. Dies ist auch ein wichtiges Merkmal, das hat Vorteile bei der Minimierung der Verschmutzung und Verlust des genetischen Materials. Dennoch ist darauf hinzuweisen, dass die Verwendung von eine cleane Motorhaube für die Einrichtung des IVT (Schritt 2.1) und RT-qPCR (Stufen 4.1-4.4) Reaktionen auf die Cross-Kontamination von Amplikons im Zusammenhang mit Produkten oder RNase zu vermeiden ist. Es ist auch entscheidend für die Kultur überstand, einschließlich ansteckenden Virus innerhalb eines Biosafety Kabinett (Schritt 3.3) zu einem Labor Infektionsrisiko zu verringern zu behandeln.

Eine weitere Bedeutung des direkten RT-qPCR-Tests ist, dass eine Vielzahl von viralen RNA-Kopien gleichzeitig ohne Verdünnung oder Konzentration der Probe analysiert werden kann. Wenn ein seriell verdünnter DENV 3′ UTR RNA Standard verwendet wurde, das direkte RT-qPCR-Protokoll eine lineare Standardkurve über sieben Größenordnungen produziert, und die untere Bestimmungsgrenze war 500 RNA-Kopien (Abbildung 2). Für den Nachweis von DENV im Kultur überstand infizierter Zellen, 8 x 103 bis 8 x 10-2 PFU Viren in 10 μl RT-qPCR wurden im Bereich der DENV 3′ UTR RNA Standard, und die untere Nachweisgrenze (8 x 10-2 PFU) errechnete sich 11 enthalten , 400 ± 7.077 RNA-Kopien (Abb. 3 b). Der Hinweis, wie in mehreren Flavivirus Studien18,19,20berichtet wurde das größere Verhältnis der viralen RNA-Kopien zu infektiösen Virustiter (d.h., PFU) in DENV Proben auch in dieser Studie beobachtet. Diese Überschätzung wird angenommen, dass vor allem aufgrund des Vorhandenseins von fehlerhaften (d.h.nicht-infektiösen) Viren oder kostenlose virale RNA von infizierten und tote Zellen befreit. Obwohl das Verhältnis von RNA Kopien: PFU in dieser Studie erhalten (1.1 x 105 bis 1,3 x 105 RNA Kopien/PFU) war unvereinbar mit den Daten, die zuvor gezeigte (Verhältnisse reichen von 1 bis 3 Log)21,20, kann dies der Unterschied in der Virusstämme, Zellen oder Kulturbedingungen beschäftigt zugeschrieben. Eine andere wahrscheinliche Erklärung für die Diskrepanz ist, dass da keine RNA Reinigungsprozess in der direkten RT-qPCR-Assay beschriebenen beteiligt war, mehr DENV-RNA in der Kultur Überstand durch Echtzeit-PCR-Analyse ohne den Verlust von viralen nachgewiesen werden konnte genetischen Materials.

Die Einfachheit der direkten RT-qPCR verbessert die Fähigkeit, eine große Anzahl von Proben in Multi-gut-Formate, wie z. B. einer 96-Well-Platte zu behandeln. Daher wird diese Eigenschaft die zukünftige Anwendung der direkten RT-qPCR-Assay eine Hochdurchsatz-Screening-Studie für die Entdeckung der Anti-DENV Medikamente helfen. In der Tat, in diesem Bericht Anwendung des direkten RT-qPCR-Assays für die Validierung der Hemmstoff Anti-DENV, MPA, wurde untersucht, und das Ergebnis zeigte, dass ein IC50 Wert von MPA erhalten durch die direkte RT-qPCR-Assay (Abbildung 4) vergleichbar mit der in früheren Studien mit Plaque-Assay12,13berichtet. Dies zeigt, dass direkte RT-qPCR ein nützliches Assay ist für die Bewertung entsprechend der inhibitorischen Wirkung von antivirale Wirkstoffe und kann in einem Drogen-screening-Studie in Zukunft erlassen werden.

In dieser Studie wurden Versuche unternommen, die direkte RT-qPCR für die Erkennung von anderen RNA-Viren gelten. Wie in Abbildung 5dargestellt, wenn 10-divisibel Verdünnungen von drei anderen RNA-Viren (YFV, beiden und MeV) in verschiedene Gattungen unterteilt (Flaviviridae, Togaviridaeund Paramyxoviridae, beziehungsweise) wurden untersucht bisher Sonden gemeldete Primern und Fluorogenic spezifisch für den jeweiligen viralen RNA-Sequenzen. Gute Korrelationen zwischen infektiöse Titer und Ct-Werte wurden durch direkte RT-qPCR-Assays erzielt, und die Korrelationen wurden 4-6 lineare Größenordnungen. Dies deutet darauf hin, dass die direkte RT-qPCR Protokoll anpassbar an verschiedene Arten von RNA-Viren indem Sie einfach die Virus-spezifische Primer und Fluorogenic Sonden.

Allerdings variiert die Nachweisempfindlichkeit unter den Viren getestet in dieser Studie (Abbildung 5). Eine Änderung des Protokolls, die den Nachweis von Virus-RNA Ziel verbessern können sollte, um einen neuen Satz von Primer/Sonden Sequenzen verwenden. Darüber hinaus ist ein entscheidender Schritt für die erfolgreiche direkte RT-qPCR-Assay gedacht, um die effiziente Veröffentlichung des Virusgenoms während der Probe Verarbeitung Schritt (Schritt 3.1-3.4) sein. Dies wäre von besonderer Bedeutung für den quantitativen Nachweis von stabilen Viren wie z. B. unbehüllte Viren. Obwohl als einem Vorversuch Coxsackievirus B3 (CVB3), ein unbehüllte RNA-Virus zu Ausmaß, gehören die direkten RT-qPCR-Assay mit zuvor beschriebenen CVB3-spezifische Primer und fluoreszierende Sonde22, unterzogen wurde ein positiven Amplikons Signal konnte nicht sogar mit einem High-Titer (1 x 105 PFU/mL) Virus bestand nachgewiesen werden. Dies gilt vor allem die hohe körperliche Unversehrtheit unbehüllte Viren zugeschrieben werden. So weit einige RT-PCR-Assays, die keine Reinigung von Nukleinsäuren wurde entwickelt, um verschiedene RNA-Viren zu erkennen, die verschiedene Protokolle in der RNA-Version beschäftigen Schritt23,24,25, 26. Verwendung der alternative (oder zusätzlichen) Behandlungen, wie z. B. eine Inkubation einer Virus-Probe bei einer hohen Temperatur erhöht damit, möglicherweise die Nachweisempfindlichkeit.

Zusammenfassend lässt sich sagen war die direkte RT-qPCR-Protokoll, das in dieser Studie entwickelt eine einfache und schnelle, aber zuverlässige Methode zur Quantifizierung der viralen RNA in einer Kultur Überstand der infizierten Zellen. Wegen dieser Einfachheit könnte die direkte RT-qPCR-Assay eine Anzahl von Proben in kurzer Zeit verarbeiten, was Versprechen für die Hochdurchsatz-Analyse der Virusreplikation hält. Darüber hinaus zeigte sich auch die Anwendung der direkten RT-qPCR-Protokoll auf andere RNA-Viren. Dieser Ansatz sollte daher ein nützliches Werkzeug für die effiziente Überwachung der RNA-Virus-Infektionen in einer Laborumgebung Forschung und, möglicherweise, in klinischen Diagnosen.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Subhash G. Vasudevan (Duke-NUS Graduate Medical School, Singapur) für DENV-2 für die YFV EDEN2 3295 und Shunro Imura (Quarantäne-Station Kōbe) isolieren 17d Impfstamm. Die Autoren sind auch die Mitglieder der Abteilung für Mikrobiologie und Infektion-Steuerung für ihre Unterstützung dankbar. Diese Arbeit wird unterstützt durch MEXT KAKENHI Grant Nummer JP16737900.

Materials

PrimeSTAR Max DNA Polymerase Takara Bio. Inc R045A Comparable PCR reagent kit can be used.
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific A24811 Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
6x Gel Loading Dye New England BioLabs B7024S Comparable gel loading dye can be used.
2-Log DNA Ladder New England BioLabs N3200 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used.
Gel Scene Tablet Astec GST-33 Comparable gel imaging system can be used.
illustra GFX PCR Purification Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9034-70 Comparable gel extraction kit can be used.
BioSpectrometer Eppendorf 6135000905 Comparable spectrophotometer can be used.
MEGAscrip T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334
TURBO DNase Thermo Fisher Scientific AM2238 Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit.
Recombinant RNase Inhibitor Takara Bio. Inc 2313A 40 units/μL
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Comparable RNA purification kit can be used.
CellAmp Direct RNA Prep Kit Takara Bio. Inc 3733Q
Proteinase K Nacalai Tesque 15679-06 > 600 units/mL. Comparable reagent can be used.
iTaq Universal Probes One-Step Kit Bio-Rad 1725141
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL Thermo Fisher Scientific 4346907 Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube.
StepOnePlus Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific StepOnePlus-01 Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
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Suzuki, Y., Kotoura, M., Yashima, S., Wu, H., Nakano, T., Sano, K. Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (141), e58407, doi:10.3791/58407 (2018).
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