实时定量聚合酶链反应检测感染细胞培养中的登革热病毒 rna

对于 rt-qpcr 分析对 denv rna 进行定量, 已知拷贝数的标准是一个先决条件, 该标准可以通过相同的引物集检测到。在该协议中, 含有 denv-2 ngc 菌株 3 ‘ utr 序列的462个核苷酸长 rna 从 t7 rna 启动子熔融 denv-2 ‘ utr dna 模板体外转录, 该模板已通过 pcr 扩增并纯化 (图 2 a 和当标准 denv rna 连续10倍稀释 (从 5 x 10 9 到 5 x 10 2 拷贝在 10μl rt-qpcr 反应中) 时, 使用 3 ‘ utr特特异性引物和氟探针9(线性) 进行直接的 rt-qpcr 分析得到了相关系数好的曲线 (r2 = 0.987 26) (图 2c)。 其次, 应用该直接 rt-qpcr 检测方法对感染病毒细胞培养上清液中的 denv 进行了定量。denv-2 (新加坡分离体 eden2 329510) 在 C6/36 蚊子细胞中繁殖, 并利用 bhk-21 细胞11进行斑块分析, 连续稀释 (从 8 x10 6 到80个斑块形成单元 [pfu]/ml)。然后用含有蛋白酶 k 的等量的处理缓冲液对 denv 样品进行处理, 以清除病毒, 并进行针对 denv 3 ‘ utr rna 序列的直接 rt-qpcr 检测。再次, 得到了一个很好的相关性 (r2 = 0.99981) 之间的 denv 传染滴度和 ct, 一个周期数字, 被认为是点, 荧光信号上升与指数增长以上的背景, 获得了 (图 3 a)。当使用体外转录 3 ‘ utr rna 制作的标准曲线上绘制由连续稀释 denv 库存产生的 ct 值时 , 从 8 x 10 6 到 80 puum/l 获得的所有图 (等于 8 x10 3 到在 10μl rt-qpcr 反应中的 8 x 10-2 pfu) 在标准 rna 的范围内 (5 x 10 9 到 5 x 10 x 10在 10μl rt-qpcr 反应中,图 3b), 表明 denv 样品具有广泛的传染性可以同时分析滴度, 使用这种直接的 rt-qpcr。在平行实验中, 研究了用 rt-qpcr 分析处理缓冲液或蛋白酶 k 治疗对病毒 rna 检测的影响。尽管先使用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 对 denv 样品 (8 x10 6 至 8x 10 2 ppu/l) 进行日志稀释处理对 rt-qpcr (1:1 稀释病毒样本与 pbs 和孵育 25°c 10分钟和 75°c 5分钟) 得到了 回归曲线 (图 3c, 黑线) 和 pbs 处理获得的平均 ct 值与处理缓冲蛋白酶 k 处理获得的 ct 相比, 延迟了2.6-3.2 周期 (图 3c, 虚线)。此外, 这种 pbs 处理无法检测到病毒的最高稀释度 (8 x 10 2 ppu/l [8 x 10-1 pfu 每 10μl rt-qpcr 反应]) (图 3c).在处理缓冲处理过程中没有蛋白酶 k (图 3c, 灰线), 也会产生类似的回归;然而, 相对于含有蛋白酶 k 的加工反应 (图 3c, 虚线), 仍然观察到扩增延迟 (0.1-0.8循环)。这些数据表明, 在所测试的条件中, 用处理缓冲液和蛋白酶 k 处理 denv 样品可以提高 rt-qpcr 检测的灵敏度。 直接 rt-qpcr 检测进一步评估了其在检测 denv 抗病毒药物方面的适用性。霉酚酸 (mpa) 是一种单磷酸肌脱氢酶的非核苷抑制剂, 在移植中用作免疫抑制剂, 在体外12,13被报道抑制 denv。尽管以前的研究采用了常规的斑块检测或流式细胞仪检测病毒抗原来证明 mpa 对 denv感染 12,13的抑制作用, 但在本研究中, 直接 rt-qpcr 是用于评估 mpa 的抗病毒活性。在感染前1天在24井板中播种密度为 5×10 4的 hela 细胞, 在1h 的 moi 下暴露在 denv-2 中, 经清洗后, 在 50–0.016 gm/l/(或0.1% 的二甲基亚硫酸 [dmso])。本培养上清液在感染3天后采集, 并采用 denv3 ‘ utr 特异性引物和荧光探针进行直接 rt-qpcr 检测。图 4显示了在受感染细胞的培养中的 denv rna 拷贝 (每个反应), 这些细胞的 mpa 浓度不断增加, 由体外转录的 3 ‘ utr rna 标准测定。通过 50μgml (156μm) mpa 处理, 可以将 dmso 处理后的控制培养物减少到 99.87±0.02% (图 4)。重要的是,由图 4所示数据确定的 mpa ic50 (50% 抑制浓度) 值为0.79 微米, 与先前报告的12,13的值相似。因此, 这一结果表明, 这种直接的 rt-qpcr 检测方法是评估抗病毒药物对 denv 感染的抑制作用的一种有用和可靠的方法。 最后, 测试了直接 rt-qpcr 检测在其他 rna 病毒中的应用。当在 vero 细胞中扩增并在 bhm-21 细胞上滴定的黄热病病毒 (yfv) 17d 疫苗株 (Flaviviridae) 中, 使用 yfv-17d 特异性引物和氟探针14直接接受 rt-qpcr, 如如表 1所述, 通过10倍连续稀释病毒库存 (3.2 x 10 至 3.2 puum/l, 图5a) , 可以生成病毒滴度与 ct 值之间具有良好直接相关性的标准曲线。同样, 直接 rt-qpcr 分析基孔肯雅病毒 (chikv, togaviridae) ross 菌株库, 该菌株在 vero 细胞中被扩增, 并在 bhk-21 细胞上滴定, 使用 chikv 特异性引物和荧光探针 15 (表 1),在传染性滴度 (4.4 x 10 8 到 4.4 x10 x 10 3 puml) 和 ct 值 (图 5b) 之间有很好的回归.这也是检测麻疹病毒 (mev、 paramyoviridae) 的系列稀释 (8 x 10 2 至8 x 10-2 puum/ml,图 5c) 的情况, 以前使用的是 vero 细胞的传播和滴定。报告的引物和氟原探针16 (表 1)。这些数据证明了直接 rt-qpcr 检测方法对各种 rna 病毒定量检测的适应性。 图 1: 直接 rt-qpcr 检测的工作流程.用含有蛋白酶 k 的处理缓冲液对感染 denv 的细胞进行培养上清液处理, 释放病毒 rna (样品处理步骤)。然后将处理后的样品与一步 rt-pcr 试剂混合, 并使用 denv 3 ‘ utr 特异性引物和荧光探针进行实时 pcr 检测。在各自样本中检测到的病毒 rna 水平可以通过体外转录 denv rna 的连续稀释标准来确定。请点击这里查看此图的较大版本. 图 2: denv 3 ‘ utr rna 生成的标准曲线.(a) 从 t7 rna 启动子序列融合 pcr 片段中外传含有 3 ‘ utr 的 denv-2 ngc 的标准 rna。(b) 在1% 琼脂糖凝胶 (右车道) 上显示纯化的 denv 3 ‘ utr rna (250 纳克)。左车道显示了 rna 电泳的分子量标记。(c) 使用含有蛋白酶 k 的加工缓冲液对 denv 3 ‘ utr rna 标准进行日志稀释, 并使用一步 rt-qpcr 试剂和 denv 3 ‘ utr 特异性引物和荧光探针组进行实时 pcr 分析。在各自稀释中获得的平均 ct 值 (n = 3) 是根据 3 ‘ utr rna 的估计数量绘制的 (在10μl rt-qpcr 反应中, 5 x 10 9 到 5 x10 x 10 2 rna 副本)。r2是相关系数。请点击这里查看此图的较大版本. 图 3: 直接 rt-qpcr 对病毒库存中的 denv rna 进行定量.(a) 在 c626 细胞中生产的高滴度 denv-2 库存被连续稀释 10倍 (8 x10 6至 8 x10 x 10 1 pfu ml), dmem% fbs 含有 rnase 抑制剂, 并使用 denv 3 ‘ utt 特异性引物进行直接 rt-qpcr 检测比普里(b) 用日志稀释 denv 股票 (圆圈) 的 rt-qpcr 获得的 ct 值绘制在 3 ‘ utr rna (三角形) 在体外转录的标准曲线上。在直接 rt-qpcr 检测中使用 8 x10 6 pfu 或库存相当于 10μl rt-qpcr 反应中的 8 x 10 3 pfu 病毒.(c) 该面板显示了处理缓冲液和蛋白酶 k 处理对病毒 rna 检测的影响。denv 稀释库存 (8 x 106至 8 x8 x 10 2 ppul) 用同等数量的处理缓冲液孵育, 其中含有蛋白酶 k (白圈)、单独处理缓冲液 (灰圈) 或 pbs (黑圈), 然后直接进行直接rt-qpcr 检测。请点击这里查看此图的较大版本. 图 4: 直接 rt-qpcr 评价 mpa 的抑制作用.hela 细胞在1的 moi 下被感染 denv-2, 并在 mpa 浓度不断增加的情况下培养, mpa 是先前报告的 denv 抑制剂 (或 0.1% dmso)。感染三天后, 收集受感染细胞的培养上清液, 并采用 denv 3 ‘ utr 特异性引物探针进行直接 rt-qpcr 检测。病毒 rna 的拷贝数是用 denv 3 ‘ utr rna 标准体外转录确定的。请点击这里查看此图的较大版本. 图 5: 直接 rt-qpcr 检测其他 rna 病毒的应用.对 (a) yfv、(b) chikv 和 (c) mev 的系列稀释病毒库存进行了直接的 rt-qpcr 检测, 使用 pcr 引物和各自病毒 rna 序列特有的荧光探针。请点击这里查看此图的较大版本. 目的 名字 序列 (5 ‘-3 ‘) 注意 t7 启动子熔融 denv-2 3 ‘ utr cdna 扩增 t7-denv 3 ‘ utr fwd taac gaa tca tcatag gaa c gaa t ta gaagggc aaa act aac atg aac ag aac aaa 意大利 t7 促进剂;小写, 间隔;粗体, denv-2 ngc 核苷酸10270-10292 denv 3 ‘ utr rvs aga acc tgt tga ttc aac agc denv-2 ngc 核苷酸10723-10703 denv 的 rt-qpcr 分析 denv-2 3 ‘ utr f aag gac tag agg tta gag gag acc c 参考9 denv-2 3 ‘ utr ggc gtg tgg tgc ctg gaa tgg 探头 2 den-2-4 6am-aac agc ata ttg acg gga aag acc-tamra yfv 的 rt-qpcr 分析 yfv ns5 f gaa cag tga tca gga acc ctct 参考14 yfv ns5 r gga tgt ttt cac agt aaa tgt g yfv ns5 探头 6fam-cta cgt tgg agc ccg cag cag caa t-tamra chikv 的 rt-qpcr 分析 chik e1 f cgg cgc ctt ctt taa 参考15 chik e1r atc gaa tgc acc gca cac t chik e1 p 6am-acc agc ctg ccca ttc ctct ct aga c-tamra mev 的 rt-qpcr 分析 mev n f tgg cat ctg aac tcg gta tca c 参考16 mev n r tgt cct cag tag tat gca ttg caa mev n p 6fam-ccg agg atg caa ggc ttg ttt cag a-tamra 表 1: 本研究中使用的寡核苷酸引物和荧光探针序列。 组件 库存集中度 体积 (μl) 最终浓度 primestar 最大预混料 2倍 25 1个 t7-denv 3 ‘ utr fwd 1μm 10 200 nm denv 3 ‘ utr rvs 1μm 10 200 nm pEU/DENV 3 ‘ utr 1 ngμl 1 20 pg/μl 无核酸酶 h2o 4个 总 50 表 2: 用于制备 denv 3 ‘ utr 模板 dna 的 pcr 混合物的成分。 组件 库存集中度 体积 (μl) 最终浓度 t7 序列融合 denv 3 ‘ utr dna 模板 (变量) X 每次反应100纳克 atp 解决方案 75 mm 2 7.5 米 ctp 解决方案 75 mm 2 7.5 米 gtp 解决方案 75 mm 2 7.5 米 utp 解决方案 75 mm 2 7.5 米 反应缓冲器 10倍 2 1个 t7 酶混合物 2 重组 rnase 抑制剂 40 units/μl 1 2个 units/μl 无核酸酶 h2o 7-x 总 20 表 3: 用于合成 denv 3 ‘ utr rna 标准的 ivt 混合物的成分。 组件 库存集中度 体积 (μl) rt-qpcr 反应中的最终浓度 itaq 万能探针反应混合物 2倍 5.00 1个 高级逆转录酶 40x 0.25 每次反应100纳克 primer/探针混合 denv-2 3 ‘ utr f:3μm 1.00 300 nm denv-2 3 ‘ utr:3μm 300 nm 探头 2 den-2-4: 2μm 200 nm 无核酸酶 h2o 1.75 次 全 切除 8.00 表 4: 用于实时 denv rna rna rt-qpcr 分析的主混合物的成分.请注意, 加工后的 denv 样品 (或标准 rna) 应添加到8μl 主混合中 (每次反应共 10μl)。