Изоляция физиологически активных тилакоидов и их использования в энергии зависимых белков транспорт анализов
Summary
Мы представляем здесь протоколы изоляции высокодоходные физиологически активных тилакоидов и анализов транспортного белка для хлоропластов Твин аргинин транслокация (cpTat), секреторную (cpSec1) и сигнал признания частиц (cpSRP) пути.
Abstract
Хлоропластов являются органеллы в зеленых растений, ответственная за проведение многочисленных важнейших метаболических путей, прежде всего фотосинтеза. В хлоропластах тилакоидной мембраны системы дома фотосинтетических пигментов, реакция центра комплексов и большинство носителей электронов, а отвечает за синтез АТФ светозависимой. Свыше 90% белков хлоропласта кодируются в ядре, переведены в цитозоле и впоследствии импортирован хлоропластов. Дальнейший перенос белков в или поперек тилакоидной мембраны использует один из четырех транслокации пути. Здесь мы описываем высокодоходный метод для изоляции транспорта компетентных тилакоидов из гороха (Pisum sativum), наряду с транспорта анализов через три энергии зависимой cpTat, cpSec1 и cpSRP опосредованного пути. Эти методы позволяют эксперименты, касающиеся тилакоидных белков локализации, энергетика, транспорт и механизмы транслокации белка через биологические мембраны.
Introduction
Почти все из белковых техники отвечает за надлежащее хлоропласта функция должна перемещен из цитозоль1. В хлоропласте конверты белковых субстратов импортируются через translocon внешней мембраны (TOC) и translocon внутренняя мембрана (TIC)2. Дальнейшей ориентации тилакоидной мембраны и Люмене происходит через Твин аргинин транслокация (cpTat)3, секреторную (cpSec1)4, сигнал признание частиц (cpSRP)5и спонтанное вставки пути6 . Метод для изоляции высокодоходные физиологически активных хлоропластов и тилакоидной мембраны для измерения энергетики и кинетика транслокации события, чтобы понять различные транспортные механизмы в каждом пути и для локализации особое белкового субстрата, представляющие интерес для любого из шести отдельных отсеков хлоропластов.
Изоляция мембраны из хлоропласта предлагает более экспериментальный контроль над экологических факторов (например, концентрации соли и субстрат, присутствие СПС/гтп и рН условий), которые влияют на измерение энергетики транспорта и Кинетика. Эта среда в vitro поддается исследованию механистический деталей транслокации по тем же причинам. Кроме того хотя интеллектуального программного обеспечения для локализации хлоропласта белков улучшилась7,8, в пробирке анализов транспорта обеспечивают быстрый метод для подтверждения над микроскопии основанные флуоресцентные анализов требуют генетически закодированный флуоресцентные метки, трансформации растений и/или специфических антител. Здесь мы представляем протоколы хлоропластов и тилакоидов изоляции от горох (Pisum sativum), а также для транспорта анализов, оптимизированы для каждого пути транслокации энергии зависимых тилакоидов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изоляция хлоропластов и тилакоидов
Чрезмерная поломки может привести в бедных хлоропласта изоляции и, таким образом, бедных тилакоидов выход после разделения в градиенте. Это лучше для гомогенизации собранного ткань мягко путем обеспечения того, чтобы все материалы погр…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот манускрипт был подготовлен при финансовой поддержке Отдела химических наук, наук о земле и Biosciences, 408 Управление основных энергетических наук Департамента энергетики США через Grant де-SC0017035
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
Referencias
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. . Plastid Biology. , 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. . Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Bioquímica. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
