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Deteção de 3-Nitrotyrosine em ambientes atmosféricos através de alta performance sistema Detector eletroquímico-cromatografia líquida

Published: January 30, 2019
doi:
10.3791/58371
, , , , ,
1Department of Public Health,Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry, and Pharmaceutical Sciences, 2Department of Pathophysiology-Periodontal Science,Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences

Summary

Apresentamos um método para detectar modificações químicas 3-nitrotyrosine de proteínas atmosféricas com 6 rodadas de mm de diâmetro, cortadas de pré-filtros de amostrador de ar com um alto desempenho detector de eletroquímica-cromatografia líquido (HPLC-ECD).

Abstract

3-nitrotyrosine (3-NT) é gerada a partir do resíduo de tirosina em bio-aerossol atmosférico proteínas através de uma reação com ozônio (O3) e de dióxido de azoto (NO2). 3-NT estável é um marcador específico para os danos oxidativos e é relatado para ter um efeito promotive para provocar alergias. No presente estudo, nós relatamos o desenvolvimento de um ensaio altamente sensível para quantificar 3-NT em filtros de amostrador de ar para coletar < 2,5 µm de matéria particulada (PM2.5) de ar ambiental urbano, incluindo bio-aerossol. Neste método, um 6 mm de diâmetro furo redondo foi cortado dos filtros dos amostradores de ar e misturado com uma cocktail de protease inespecífica para hidrolisar proteínas. Amostras da proteína digeridas para o nível de aminoácidos foram testadas para 3-NT usando um alto desempenho detector de eletroquímica-cromatografia líquido (HPLC-ECD). O teor máximo de 3-NT foi detectado em um pré-filtro para PM de tamanhos de 4,5 a 7,3 μm, com um limite de detecção de 1,13 pg/m3.

Introduction

Aerossol ou PM no ar contém proteínas de várias origens biológicas, incluindo vírus, procariontes, fungos, plantas (pólen) e animais (insetos, humanos)1. A relação do conteúdo de proteína na PM é estimada em cerca de 5%, que tem sido implicados para desempenhar um papel importante como um alérgeno no ar2. Relatórios recentes sugerem que aerossol ambiente urbano de vários tamanhos contêm aminoácidos com taxas que variam entre 0,5% e 2%3. Além disso, modificações químicas das proteínas PM têm sido sugeridas para ser gerado pelas reações de proteínas com diversos poluentes, tais como O3, dióxido de azoto (NO2) e de dióxido de enxofre (SO2)4.

3-NT — uma modificação de proteína — é gerado pela nitração de resíduos de tirosina. Uma concentração maior de O3 e não2 foi mostrada para promover a nitração de moléculas de proteína no espaço pseudo atmosférica5,6. A nitração de resíduos de tirosina na corrente do polypeptide aumenta o potencial de pólen proteínas7. Assim, a quantificação e a avaliação no ar 3-NT é um aspecto importante em responder às preocupações de saúde ambiental.

3-NT também é conhecido como um biomarcador de oxidativo e nitrosative stress8. Um conjunto emergente de evidências tem demonstrado uma associação significativa de conteúdo 3-NT com várias doenças humanas9,10. Devido a seus efeitos prejudiciais, a detecção e estimativa quantitativa de 3-NT em uma amostra biológica segurem grande relevância na determinação da condição de saúde do indivíduo. Nos últimos anos, foram introduzidos diversos métodos para estimar o conteúdo de 3-NT, incluindo ensaios de enzima-lig da imunoabsorção, HPLC e LC/MS11. Em estudos anteriores, informamos um método de deteção usando a técnica de HPLC-ECD agraciada com várias vantagens em comparação com os métodos anteriores. Por exemplo, o HPLC-ECD não requer um procedimento de extração ou derivatização que torna um sistema de ensaio relativamente simples12. Confirmamos que este método é aplicável para detectar 3-NT de amostras biológicas (plasma de humanos e ratos).

Apesar de muitas investigações têm enfatizado a detecção de 3-NT em amostras biológicas, sua detecção em amostras nonbiological continua elusiva, e, portanto, o presente estudo tem sido perseguido. Na verdade, para avaliar o efeito prejudicial no ar 3-NT, um método quantitativo é útil para detectar 3-NT diretamente de partículas suspensas no ar é necessário; Portanto, foi aplicado o método de HPLC-ECD existente para detectar 3-NT de PM2.5 coletados em um filtro de fibra de vidro. Usando a técnica, 3-NT poderia ser detectada diretamente de pequenas peças (6 mm de diâmetro redondo buracos) da amostra através de um filtro de coleção de PM. Nós ainda mais avaliado o conteúdo do 3-NT para vários tamanhos de PM e medida do limite de detecção do 3-NT. O presente artigo propõe um método elevado-sensível e de alta produtividade para detectar 3-NT diretamente de amostras nonbiological e biológicas.

Protocol

1. coleção de Total suspenso PM2.5, partículas ou PM7e o método de hidrólise para proteínas de PM Recolha a PM através de um filtro de pré-filtro ou backup. Anteriores à coleta de partículas em suspensão totais (TSP), PM2.5e PM7, pese o filtro de quartzo.Nota: Dado que a contaminação por PM proteínas e peptídeos não deve afetar a detecção de nitração da tirosina (como lhes falta um grupo nitro), não tratamos o filtro de quartzo em alta temperatura antes da medição. Além disso, 3-NT conteúdo no filtro de quartzo estava abaixo do limite de deteção, conforme determinado por HPLC-ECD. Defina o filtro de quartzo em uma amostra de ar de alto volume com um seletor de tamanho de partícula para coletar PM7 em uma taxa de fluxo de 1.000 L/min continuamente por 7D (figura 1B). TSP pode ser coletado em um filtro de quartzo sem um seletor de tamanho (figura 1A). Recolher a PM2.5 usando um sampler de baixo volume de ar com uma unidade de classificação do tamanho de uma vazão de 116 L/min continuamente para 7 m. utilizar o aparelho, as partículas podem ser classificadas como PM2.5-4.5, PM7.3-4.5, PM15-7,3e TSP-PM15 e coletados em filtros de quartzo para classificação. PM2.5 podem ser coletados em um filtro de reserva (Figura 1). Registre o volume de fluxo total no momento da coleção de filtro. Medir o peso do TSP, PM2.5e PM7 sobre os filtros subtraindo o peso pré-colheita do peso postcollection. Selar o filtro em um saco plástico e guarde-a-30 ° C até a próxima etapa (ver secção 2). Proteolyze as amostras. Dissolva o cocktail de protease inespecífica com um tampão de acetato 0,1 M (pH 7,4). Coloque a solução em uma membrana de diálise (corte de peso molecular = 5.000 Da) e mergulhe-a em 1 L de tampão de acetato 0,1 M agitando a 4 ° C. Substitua o tampão de 2 x cada 12 h e em seguida realizar diálise durante a noite para remover 3-NT endógena e nitrito (NO2–). Após a diálise, recolher a solução e medir a concentração de proteína por ensaio de proteína (BCA) ácido bicinchoninic. Soco círculos redondos de 6 mm fora o pré-filtro ou filtro de backup e colocá-los em microtubos. Até cinco peças de frações de 6 mm pode ser usado para a análise (Figura 2). Adicione 300 µ l de tampão de 0,1 M de acetato contendo 50 µ g de proteína da protease inespecífica cocktail (preparado na etapa 1.2.1) ao tubo para hidrolisar as proteínas PM a 50 ° C, durante 16 h com rotação.Nota: Para subtrair endógena 3-NT a partir da solução de cocktail de protease inespecífica, é necessário preparar e digerir uma amostra de somente coquetel de protease inespecífica. Lave a membrana de ultrafiltração, juntamente com seu tubo fornecido pela adição de 0,1 M de tampão de acetato e centrifugação (10.000 x g por 30 seg; a velocidade exata depende da membrana), devido à contaminação química semelhante ao 3-NT na membrana. Repita o enxágue 1 x. Pós-proteólise, Centrifugar as amostras a 2.500 x g durante 10 min. o sobrenadante de carga para a membrana de ultrafiltração e centrifugá-la a 10.000 x g e 4 ° C para ultrafiltração (MWCO = 10.000), até um volume suficiente de eluição é coletado. Armazene os eluídos a 4 ° C no escuro.Atenção: Devido a detecção de um pico semelhante ao 3-NT na coluna de rotação, é necessário lavá-lo bem com água limpa ou com um buffer como água HPLC e um tampão de acetato 0,1 M prévia para usar. 2. determinação do teor de 3-NT no TSP, PM2.5e7PMatravés de alta performance cromatografia líquida e sistema de deteção de eletroquímica (HPLC-ECD) Nota: Consulte a Figura 3. Prepare a fase móvel. Prepare 0,2 M fosfato tampão (pH 2.5) contendo 50 mg/L EDTA. Medida fora 98 volumes do buffer e dois volumes de acetonitrilo (grau HPLC), derramá-las em uma garrafa de vidro limpa e misture vigorosamente com uma tampa. Resolver a fase móvel à temperatura ambiente durante várias horas até que o ar dissolvido se plana.Nota: Se o sistema é iniciado mais cedo, a fase móvel pode ser lisada e desgaseificada sob vácuo. No entanto, excesso de desgasificação mudará a relação entre a água e a fase orgânica através da evaporação. O sistema de HPLC-ECD consiste de uma bomba, uma coluna de HPLC, um desgaseificador, um ECD e um injector. Equilibrar a fase móvel e estabilizar o sistema para reduzir o fundo e o ruído. Instale a fase móvel e a coluna HPLC no sistema de HPLC. Ligue a bomba HPLC e estabilizar a coluna com a fase móvel a um débito de 500 µ l/min à temperatura de 25 ° C coluna do dia antes do início do dia. No dia seguinte, inflamar o ECD e definir os parâmetros (a tensão de redução no-900 mV e a tensão de excitação em 400 mV). Estabilizá-la pelo menos 3 h. Medir a concentração de 3-NT no PM7. Prepare as diferentes concentrações de padrões 3-NT (5-500 nM) e um espaço em branco (sem a 3-NT padrão e inespecífica protease cocktail, para certificar-se o frasco nem o buffer está contaminada) em um tampão de acetato 0,1 M. Execute o processador de dados HPLC. Colocar os frascos de amostra no auto-injector e conjunto o volume de injeção de 25 µ l. operar nas mesmas condições da fase móvel e a taxa de fluxo, como mencionado na etapa 2.2.1.Nota: Se a preparação da amostra estiver completa, deve haver amostras, um standard (5-500 nM), uma amostra de somente coquetel de protease inespecíficos e um tubo de ensaio em branco. Certifique-se de que a linha de base no cromatograma é plana e iniciar a injeção de amostra.Nota: Geralmente, 3-NT é detectado em 20-21 min; no entanto, recomenda-se cerca de 30 min, como o tempo de execução por injeção de amostra. Caso contrário, picos de contaminante serão incluídos na próxima execução. 3. análise dos cromatogramas e quantificação do conteúdo 3-NT na PM7 Verificar o pico 3-NT os cromatogramas e calcular o teor. Após a coleta de dados, abra o arquivo de dados do cromatograma com software de análise. Desenhar uma linha através do pico 3-NT da linha de base plana e ler a altura da linha desenhada.Nota: O limite quantitativo é aproximadamente 5 nM (125 fmol em uma injeção de 25 µ l).Atenção: O eletrodo no ECD torna-se empobrecido lentamente, e o limite será elevado devido a relação S/N. Preparar uma linha de regressão de picos padrão 3-NT, calcular o declive e interceptar. Atribuir essas constantes na seguinte equação e calcular o teor de 3-NT nas amostras da seguinte maneira.Amostra 3-NT (nM) = [pico da amostra – interceptar] / inclinação EQ. (1)Nota: A curva padrão deve ser bem representada como uma linha reta entre 5 nM e 500 nM. Calcule a 3-NT em ar ambiente e a PM7 do frasco de amostra. Multiplicar a concentração 3-NT pelo volume de reação (e o factor de diluição, se for o caso) e avaliar o conteúdo de 3-NT absoluto no PM7 do círculo. Medir a área de filtro coletados e calcular o teor de 3-NT no PM total7 filtro pela seguinte equação.PM de total7 = [3-NT conteúdo no PM7 do círculo] x [relação de área de filtro7 PM, para a área do círculo] x 226.19 (no caso de conversão de toupeiras para gramas) EQ. (2) Avaliar o conteúdo de 3-NT no ambiente o ar ou PM7 dividindo o total de PM7 pelo volume de fluxo de ar total ou PM7 peso (gravado na etapa 1.1.3).

Representative Results

O princípio de HPLC-ECD é simples. Amostras contendo o alvo são separadas por HPLC coluna e fase móvel, e o alvo separado composto é reduzido e/ou oxidado no detector eletroquímico. No sistema de HPLC-ECD, um pico de 3-NT é detectado em aproximadamente 22 minutos. ECDs (PEC-510 e HTEC-500) estão ligados em paralelo na linha de HPLC. A primeira ECD reduz os grupos hidroxila nos compostos, e a próxima oxida os produtos químicos reduzidos. ECDs tem um intervalo de detecção altamente sensível do 10-15 M. Limite de detecção do sistema de HPLC-ECD foi 1.13 pg/m3, que foi calculado como o médio sinal basal (mV) de 10 partes x 3. Cromatogramas representativas são mostradas na Figura 4. Analisando um padrão 3-NT puro, um pico definitivo com uma linha de base estável pode ser detectada (Figura 4A). 3-NT na PM7 também foi medido usando 6mm, redondas amostras (Figura 4B). Sobre a precisão da capacidade de detecção 3-NT, quando um padrão 3-NT foi injetado em HPLC, o pico correspondente ao 3-NT foi detectado em um tempo de retenção de 20 minutos. Em amostras de PM, 3-NT foi separado de outras substâncias, e o pico independente foi detectado ao mesmo tempo como o padrão de retenção. Uma curva padrão típica é mostrada na Figura 5, onde a linearidade é observada entre 5 e 40 nM. Linearidade pode ser vista até 500 nM (dados não mostrados). A tabela 1 mostra o conteúdo de 3-NT na atmosfera, calculada como pg/m3 de ar. Observou-se a maior concentração de 3-NT em um PM2.5 pré-filtro em #3 (PM7.3-4.5). Figura 1 : Esquema de coleção para TSP, PM7e PM2.5. (A) as partículas em suspensão totais (TSP) são coletadas diretamente em um filtro de coleção (em uma taxa de fluxo de 1.000 L/min). (B) quando PM7 é coletado, partículas grandes são excluídas por um seletor de tamanho (em uma taxa de fluxo de 1.000 L/min). (C) PM2.5 é recolhida através de quatro pré-filtros (em uma vazão de 116 L/min). Um filtro de quartzo é comumente usado como um filtro de backup para PM7 e PM2.5 ou um filtro de coleção para TSP, conforme mostrado nesta figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Preparação de um círculo de mm-rodada 6. O filtro de coleção foi cortado usando uma ferramenta do perfurador oco com um diâmetro de 6 mm. Em seguida, a amostra foi armazenada em um microtubo de 1,5 mL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Diagrama esquemático do sistema de HPLC-ECD. 3-NT em uma amostra injetada foi separada na coluna HPLC, através da quais os fluxos de fase móvel. 3-NT foi reduzido para aminotyrosine, oxidado em iminotyrosine e eletroquimicamente detectado no detector. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Cromatogramas típicas do sistema de HPLC-ECD. (A) puro 3-NT analisado pelo sistema HPLC-ECD. Amostra de círculo de 6 mm (B) através de um filtro de7 PM usado para detectar 3-NT. Um pico de 3-NT é indicado por uma seta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 : Curva padrão de puras amostras de 3-NT. Os resultados em uma concentração mais baixa são indicados no gráfico de outro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Assunto Dias deColeção Ponto 3-NT(pg/m3 ar) PM2,5 Pré-filtro #1 27 4 8.25 ± 0,37 Pré-filtro #2 27 4 29,66 ± 1,94 Pré-filtro #3 27 4 74.37 ± 4.09 Pré-filtro #4 27 4 32.70 ± 0,75 Backfilter 7 5 4,21 ± 0,91 PM7 Backfilter 7 1 89.16 ± 6,36 COLHER DE CHÁ DE Filtro 7 1 10.34 ± 2.09 Tabela 1: 3-NT na atmosfera, medida pelo sistema de HPLC-ECD. As manchas circulares de 6 mm de cada filtro foram medidas usando o sistema de HPLC-ECD. Pré-filtros #1 – #4 foram coletados no mesmo período. Observe que as concentrações de 3-NT no ar são influenciadas por vários fatores, tais como a data recolhida, ano ou local. Os dados (n = 3-10) são representados como a média ± erro padrão.

Discussion

Este artigo descreve um método de quantificação para avaliar 3-NT na PM no ar coletada em filtros de quartzo, usando técnicas de HPLC-ECD altamente sensíveis.

Em geral, foram desenvolvidos métodos de medição 3-NT como biomarcadores de estresse oxidativo em doenças humanas. Métodos baseados em anticorpos (por exemplo, o ensaio enzima-lig da imunoabsorção) são considerados como semi quantitativa, porque não há nenhuma validação estrita do ensaio e é difícil avaliar a confiabilidade do teste. HPLC com deteção eletroquímica (ECD) e ensaios espectrometria de massa-based tem sensibilidade adequada para a quantificação do NT 313. Embora eles são sensíveis, métodos de espectrometria de massa base como GC-MS ou GC-MS/MS exigem a derivatização de aminoácidos, e o processo de derivatização muitas vezes resulta na formação de artefatos14.

Em comparação com o GC e LC técnicas, HPLC-ECD é relativamente menos caro e tem uma sensibilidade suficiente para medida 3-NT. Além disso, a etapa de derivatização em GC-MS e LC-MS muitas vezes requer tempo adicional. Embora o método apresentado aqui requer 16 horas para a etapa de digestão de proteínas, pode, no entanto, ser realizada durante a noite (conforme descrito acima, cerca de 30 minutos de tempo de hands-on é necessário, por exemplo). Medida de repetição automática usando um mostruário pode fornecer um sistema de medição de alta produtividade. Estudos anteriores relataram métodos imunológicos para medir 3-NT na PM2,7; no entanto, tais métodos não poderiam detectar 3-NT na temporada de inverno, devido aos baixos níveis de 3-NT na PM15.

O método de HPLC-ECD tem vantagens adicionais sobre outros métodos padrão; por exemplo, (i) um processo de extração não é necessário neste método, (ii) é completamente livre de detergente, (iii) tem exigência mínima de amostra e, importante, (iv) tem alta sensibilidade. Partículas que são coletadas em filtros são frequentemente separadas por sonication para investigações, incluindo a quantificação dos vários componentes. Detergentes são usados também para isolar proteínas PM-limite de filtros. No entanto, estas etapas adicionais aumentam o risco de contaminação, perda de amostra e subestimação devido a eficiência de extração, e além disso, a maioria dos detergentes são incompatíveis com LC/MS. No presente método HPLC-ECD, amostras HPLC podem ser facilmente separadas do filtro usando um simples soco oco e sem a exigência de um processo de preparação de amostra adicional. A área da amostra redondas é 28,3 mm2, que é muito pequeno comparado ao tamanho do filtro quartz original (8 x 10 polegadas = 203.2 x 254 mm = 51.600 mm2).

A condição de HPLC-ECD foi revista cuidadosamente para evitar interferência com o sinal de 3-NT, conforme descrito anteriormente,12. Um pH ácido forte da fase móvel e uma concentração adequada de acetonitrilo são importantes para a deteção. Usando estas condições, outros compostos, incluindo nitro base, podem ser separados do nitrotyrosine. A condição atual é adequada para a detecção de 3-NT de amostras com uma propriedade física diferente (por exemplo, partículas em suspensão e plasma).

Para avaliar 3-NT no ar, a medição do peso do filtro e a eliminação do fundo são passos críticos. Em geral, ao longo de aproximadamente 100 mg de PM7 são coletados ao longo de um período de quatro a sete dias; no entanto, vários fatores afetam o peso do filtro antes e após a coleta de7 PM, incluindo a humidade e a carga elétrica estática. Para evitar esses efeitos, a estabilização do peso filtro por longos períodos é necessária sob umidade e temperatura subequal. O local onde o contrapeso eletrônico está instalado deve ser mantido em um ambiente estável. Para a preparação da amostra, é importante corrigir os efeitos de fundo do cocktail de protease inespecífico e a membrana de ultrafiltração, que muitas vezes mostram um pico semelhante ao 3-NT.

Esse método pode ser aplicado a outras partículas, incluindo aqueles em ambientes internos. A nitração de proteínas pode aumentar seu potencial alergénico2. Portanto, esse método pode ajudar a avaliar a limpeza ambiental e evitar estresse nitrosative.

Neste estudo, nós relatamos um método de medição altamente sensíveis para 3-NT atmosférica amostrador de filtros de ar com aparelhos baratos e de fácil de manusear. A geração de 3-NT na atmosfera está associada a poluentes ambientais, tais como O3, nenhum2, PM proteínas e elementos meteorológicos que afetam a alergenicidade humana. Em conclusão, o método desenvolvido no presente inquérito pode ajudar a avaliar a reação atmosférica de proteínas PM sob várias condições meteorológicas, vários poluentes e O3. Com estes esforços de desenvolvimento de HPLC-ECD para uma estimativa de 3-nitrotyrosine na atmosfera, prevemos a melhor limpeza ambiental, melhorar a saúde humana.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecer Masayuki Kubo de nos agência de proteção ambiental por sua ajuda com a amostragem de2.5 TSP/PM. Este trabalho foi financiado em parte por JSPS KAKENHI Grant número JP16K15373 e JP18H03039.

Materials

Quartz filter, backup quartz filter PALL life sciences 7204 Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in
High-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY HV-1000F
Particle size selector for SPM SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY 080130-061 SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.  SPM is almost identical to PM7.
Low-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600F
Size classification unit for PM2.5 SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) Tokyo Dylec AHQ-630
Non-specific protease cocktail Roche 11459643001 Pronase from Streptomyces griseus 
3-Nitrotyrosine SIGMA N7389
Ultrafiltration membranes Millipore UFC5010BK AMICON ULTRA 0.5 mL – 10kDa cutoff
ECD Eicom HTEC-500, PEC-510 standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump
HPLC column Eicom SC-5ODS
Data processor Eicom EPC-300
Injector Hitachi High-Tech Science  L-7200 Auto sampler
Analyzing software eDAQ Japan ES280  PowerChrom software
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Referencias

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Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).
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