اكتشاف 3-نيتروتيروسيني في بيئة الغلاف الجوي عن طريق عالية أداء نظام سائل الكاشف اللوني الكهروكيميائية
Summary
نحن نقدم طريقة للكشف عن التعديلات الكيميائية 3-نيتروتيروسيني للبروتينات الغلاف الجوي مع جولات مم 6 قطع من بريفيلتيرس عينات الهواء باستخدام كاشف لوني الكهروكيميائية سائلة عالية الأداء ([هبلك]-نماء الطفولة المبكرة).
Abstract
3-نيتروتيروسيني (3-NT) يتم إنشاؤها من بقايا التيروسين في الغلاف الجوي والهباء الجوي الحيوي البروتينات عن طريق رد فعل مع الأوزون (O3) وثاني أكسيد النتروجين (رقم2). مستقرة 3-NT هو علامة معينة للضرر التأكسدي ويقال أن لها أثرا تشجيعية للحصول على الحساسية. في هذه الدراسة، ونحن تقرير تنمية مقايسة حساسة للغاية لقياس 3-الإقليم الشمالي في مرشحات الهواء أخذ العينات لجمع < 2.5 ميكرون من الجسيمات (الساعة2.5) من الهواء البيئية في المناطق الحضرية، بما في ذلك الهباء الجوي الحيوي. في هذا الأسلوب، وقطرها 6 ملم فتحه مستديرة كان قطع من عوامل التصفية لأخذ العينات من الهواء وتمتزج حوزتي غير محدد كوكتيل كي يتحلل البروتينات. تم اختبار عينات البروتين يهضم إلى مستوى الأحماض الأمينية ل 3-NT استخدام كاشف لوني الكهروكيميائية سائلة عالية الأداء ([هبلك]-نماء الطفولة المبكرة). تم الكشف عن محتوى 3-NT الحد الأقصى في prefilter للساعة أحجام من 4.5 إلى 7.3 ميكرومترات، مع الكشف عن حد من 1.13 بيكوغرام/م3.
Introduction
الهباء الجوي أو المحمولة جوا الساعة تحتوي على بروتينات من أصول بيولوجية مختلفة، بما في ذلك الفيروسات وبدائيات النوى، والفطريات، والنباتات (حبوب اللقاح) والحيوانات (الحشرات، الإنسان)1. نسبة البروتين في الساعة يقدر بحوالي 5%، الذي كان متورطا بالقيام بدور رئيسي ك حساسية المحمولة جوا2. وتشير التقارير الأخيرة إلى أن الهباء الجوي المحيط الحضري من مختلف الأحجام تحتوي على الأحماض الأمينية بنسب تتراوح بين 0.5% و 2%3. وباﻹضافة إلى ذلك، اقترحت التعديلات الكيميائية للبروتينات بعد الظهر التي ستنتج عن ردود فعل البروتينات مع الملوثات المختلفة، مثل3س، وثاني أكسيد النيتروجين (رقم2)، وثاني أكسيد الكبريت (هكذا2)4.
3-NT-تعديل بروتين – تم إنشاؤه بواسطة نترته المخلفات تيروزين. قد تبين وجود تركيز أعلى من س3 وليس2 لتعزيز نترته الجزيئات البروتينية في الفضاء الجوي الزائفة5،6. نترته المخلفات تيروزين في سلسلة ببتيد يعزز إمكانات مثيرة للحساسية من حبوب اللقاح البروتينات7. وهكذا القياس الكمي والتقييم من NT 3 المحمولة جوا جانبا مهما في معالجة الشواغل المتعلقة بالصحة البيئية.
3-الإقليم الشمالي المعروف أيضا العلامات البيولوجية للأكسدة و nitrosative الإجهاد8. وقد أظهرت هيئة ناشئة من الأدلة عصابة كبيرة من المحتوى 3-NT مع عدة أمراض الإنسان9،10. نظراً لما له من آثار ضارة، والكشف عن وتقدير كمي ل 3-الإقليم الشمالي في عينة بيولوجية يعقد أهمية كبيرة في تحديد الحالة الصحية للفرد. وقد أدخلت في السنوات الأخيرة، أساليب متنوعة لتقدير محتوى 3-الإقليم الشمالي، بما في ذلك فحوصات المرتبط بالانزيم المرتبط، [هبلك]، و LC/MS11. في دراسات سابقة، أبلغنا أسلوب الكشف عن استخدام التقنية [هبلك]-النماء أنعم بالعديد من المزايا مقارنة بالأساليب السابقة. على سبيل المثال، [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة لا تتطلب إجراء استخراج أو derivatization، مما يجعل من نظام مقايسة بسيطة نسبيا12. وقد أكدنا أن هذا الأسلوب قابلاً للكشف عن 3-NT من العينات البيولوجية (البلازما من الإنسان والفئران).
على الرغم من أن العديد من التحقيقات أكدت اكتشاف 3-الإقليم الشمالي في العينات البيولوجية، الكشف عنها في عينات نونبيولوجيكال لا يزال بعيد المنال، ومن ثم اتبعت هذه الدراسة. في الواقع، لتقييم الآثار الضارة للهواء 3-الإقليم الشمالي، كمية مفيدة للكشف عن 3-NT مباشرة من الجسيمات المحمولة جوا مطلوب أسلوب؛ ولذلك، قمنا بتطبيق الأسلوب [هبلك]-النماء الموجودة للكشف عن 3-NT من الساعة2.5 جمعت في عامل تصفية من ألياف زجاجية. باستخدام هذا الأسلوب، 3-NT يمكن الكشف عن مباشرة من الصغيرة قطعة (6 ملم-قطر الجولة ثقوب) عينة من عامل تصفية مجموعة م. ونحن كذلك تقييم محتوى 3-NT لأحجام مختلفة من الساعة وقياس حدود الكشف 3-NT. وتقترح هذه المادة طريقة حساسة عالية والفائق للكشف عن 3-NT مباشرة من عينات نونبيولوجيكال والبيولوجية على حد سواء.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة طريقة القياس الكمي لتقييم 3-الإقليم الشمالي في الساعة المحمولة جوا التي جمعت على مرشحات الكوارتز استخدام تقنيات [هبلك]-النماء حساسة للغاية.
وبصفة عامة، وضعت طرق القياس 3-NT كالمؤشرات الحيوية للأكسدة في الأمراض التي تصيب الإنسان. وتعتبر الأساليب المستندة إلى جسم (مثلاً، مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم) شبه كمي لأن هناك لا التحقق من صحة التحليل الدقيق ومن الصعب تقييم موثوقية الاختبار. [هبلك] بكشف الكهروكيميائية (النماء) وفحوصات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي بالحساسية الكافية للتحديد الكمي ل 3-NT13. على الرغم من أنها حساسة، مثل أساليب جماعية على أساس قياس الطيف الكتلي GC-MS أو تتطلب GC-MS/MS derivatization الأحماض الأمينية، ونتائج عملية derivatization في كثير من الأحيان في تشكيل التحف14.
مقارنة بتقنيات GC و LC، [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة نسبيا أقل تكلفة ولديه حساسية كافية لقياس 3-NT. بالإضافة إلى ذلك، أن الخطوة derivatization في GC-مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد-LC غالباً ما يتطلب وقتاً إضافيا. على الرغم من أن الأسلوب الذي قدم هنا يتطلب 16 ساعة للخطوة هضم البروتين، فإنه يمكن، على الرغم من ذلك، القيام بها بين عشية وضحاها (كما هو موضح أعلاه، حوالي 30 دقيقة وقت العملي مطلوب كل عينة). قد توفر قياس التكرار التلقائي باستخدام أوتوسامبلير نظام قياس الفائق. وأفادت الدراسات السابقة طرق مناعية لقياس 3-الإقليم الشمالي في الساعة2،7؛ ومع ذلك، تعذر اكتشاف هذه الأساليب 3-الإقليم الشمالي في فصل الشتاء بسبب انخفاض مستويات 3-الإقليم الشمالي في الساعة15.
الأسلوب [هبلك]-النماء مزايا إضافية أكثر من الأساليب القياسية الأخرى؛ على سبيل المثال، (ط) عملية استخراج غير مطلوب في هذا الأسلوب، (ثانيا) أنها خالية تماما من المنظفات، (ثالثا) فقد شرط الحد الأدنى من العينة، و، الأهم من ذلك، (رابعا) لها حساسية عالية. الجسيمات التي يتم جمعها على مرشحات مفصولة كثيرا ما سونيكاتيون لمزيد من التحقيقات، بما في ذلك التحديد الكمي للعناصر المختلفة. كما تستخدم المنظفات لعزل البروتينات م زمنياً من المرشحات. ومع ذلك، هذه الخطوات الإضافية تزيد من خطر التلوث وفقدان عينة، واستهانة بسبب كفاءة الاستخراج، وعلاوة على ذلك، معظم المنظفات تتنافى مع LC/MS. في هذا الأسلوب [هبلك]-النماء، عينات [هبلك] يمكن بسهولة فصل من عامل تصفية باستخدام لكمه مجوف بسيط ودون الشرط لعملية إعداد عينة إضافية. منطقة العينة مستدير هو 28.3 مم2، وصغيرة جداً بالمقارنة مع حجم التصفية الكوارتز الأصلي (8 × 10 بوصة = 203.2 × 254 مم = 51,600 مم2).
الشرط [هبلك]-النماء واستعرضت بعناية لتجنب التدخل للإشارة 3-الإقليم الشمالي، كما هو موضح سابقا12. الرقم الهيدروجيني حمضية قوية من المرحلة المتنقلة بتركيز كاف من الاسيتو الانيتريل مهم للكشف. باستخدام هذه الشروط، يمكن فصل المركبات الأخرى، بما في ذلك نيترو قاعدة، من نيتروتيروسيني. الوضع الراهن مناسبة للكشف عن 3-NT من العينات مع خاصية مادية مختلفة (مثل الجسيمات والبلازما).
3-الإقليم الشمالي في الهواء، لتقييم قياس وزن عامل التصفية وإزالة الخلفية هي الخطوات الحاسمة. وبصفة عامة، على مدى ما يقرب من 100 مغ من الساعة7 يتم جمعها على مدى فترة من أربعة إلى سبعة أيام؛ ومع ذلك، تؤثر عدة عوامل وزن عامل التصفية قبل وبعد جمع7 بعد الظهر، بما في ذلك الرطوبة وحشوه كهربائية ثابتة. لتجنب هذه الآثار، ضروري استقرار الوزن عامل التصفية لفترات طويلة تحت سوبيكوال درجة الحرارة والرطوبة. ينبغي الإبقاء على الموقع حيث تم تثبيت التوازن الإلكترونية في بيئة مستقرة. لإعداد نموذج، من المهم لتصحيح آثار الخلفية من حوزتي غير محدد كوكتيل والغشاء ultrafiltration، التي غالباً ما تظهر ذروة مماثلة إلى 3-الإقليم الشمالي.
يمكن تطبيق هذا الأسلوب للجزيئات الأخرى، بما في ذلك تلك الموجودة في البيئات المغلقة. نترته البروتينات قد تزيد بهم المحتملة للحساسية2. ولذلك، قد يساعد هذا الأسلوب على تقييم النظافة البيئية ومنع nitrosative الإجهاد.
في هذه الدراسة، ونحن تقرير طريقة قياس درجة عالية من حساسية للغلاف الجوي 3-الإقليم الشمالي من فلاتر الهواء العينة بأجهزة رخيصة الثمن وسهلة التعامل. جيل 3-الإقليم الشمالي في الغلاف الجوي المرتبطة بالملوثات البيئية مثل س3وليس2والبروتينات بعد الظهر وعناصر الأرصاد الجوية التي تؤثر على البشرية تحسسية. وفي الختام، قد تساعد الطريقة المتقدمة في التحقيقات الحالية لتقييم رد فعل الغلاف الجوي س3والملوثات المختلفة والبروتينات بعد الظهر تحت مختلف الظروف الجوية. مع هذه المساعي لتطوير [هبلك]-النماء لتقدير 3-نيتروتيروسيني في الغلاف الجوي، ونحن نتوقع تحسين النظافة البيئية، تحسين الصحة البشرية.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون ماسايوكي كوبو من “وكالة حماية البيئة الأمريكية” لمساعدته مع أخذ العينات2.5 ملعقة صغيرة/م. أيد هذا العمل جزئيا JSPS كاكينهي المنحة رقم JP16K15373 و JP18H03039.
Materials
| Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
| High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
| Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
| Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
| Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
| Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
| Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
| 3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
| Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL – 10kDa cutoff |
| ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
| HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
| Data processor | Eicom | EPC-300 | |
| Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
| Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |
Referencias
- Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).
- Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. Protein nitration by polluted air. Environmental Science & Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).
- Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols. Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).
- D’Amato, G., et al. Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).
- Bolzacchini, E., et al. Gas-phase reaction of phenol with NO3. Environmental Science & Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).
- Shiraiwa, M., et al. Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).
- Gruijthuijsen, Y. K., et al. Nitration enhances the allergenic potential of proteins. International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).
- Kubo, M., Ogino, K., Tsukahara, H., Kaneko, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. Studies on Pediatric Disorders. , 149-158 (2014).
- Thomson, L. 3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis. Disease Markers. 2015, 708282 (2015).
- Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons?. Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).
- Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. 3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges. Biochimie. 125, 1-11 (2016).
- Hitomi, Y. H., et al. Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD. Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).
- Ogino, K., Wang, D. -. H. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention. Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -. T., Gutzki, F. -. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).
- Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere. Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).
