ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל
Summary
פרוטוקול עבור הבהרה של הצמח תילקואיד חלבון הארגון מורכבים ו הלחנה אצל כחול לזיהוי יליד ג’ל אלקטרופורזה (בסון-עמוד) ותיאר 2D-מרחביות עמודים. הפרוטוקול ממוטבת עבורו תודרנית לבנה, , אבל ניתן להשתמש עבור שאר מיני צמחים עם שינויים מזעריים.
Abstract
שרשרת העברת אלקטרונים פוטוסינתטיים (וכו ‘) ממירה אנרגיה סולארית אנרגיה כימית בצורה של nadph ל ו- ATP. ארבעה מתחמי חלבון גדולה מוטבע תילקואיד ממברנה הקציר האנרגיה הסולארית להסיע אלקטרונים מן המים NADP+ ויה photosystems שני, ולהשתמש מעבר הצבע שנוצר פרוטון לייצור ATP. Photosystem PSII, סאי, ציטוכרום b6f (Cyt b6נ) ו- ATPase הם כל מכלולי multiprotein עם אוריינטציה ברורים ואת הדינמיקה בתוך הקרומית תילקואיד. ניתן לקבל מידע חיוני על הרכב ואת האינטראקציות של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד solubilizing את מתחמי מן שלמות הממברנה על ידי חומרי ניקוי עדין ואחריו ג’ל יליד electrophoretic הפרדת מתחמי. כחול מקורי לזיהוי בג’ל (בסון-עמוד) היא שיטה אנליטית משמש הפרדת חלבונים מתחמי בצורתם הטבעית ופונקציונליים. השיטה יכול לשמש עבור חלבון טיהור מורכבים עבור ניתוח מבנה מפורטת יותר, אבל הוא גם מספק כלי כדי לנתח את האינטראקציות דינמי בין מתחמי חלבון. השיטה פותחה עבור הניתוח של מתחמי מיטוכונדריאלי חלבון בדרכי הנשימה, אבל מאז כבר אופטימיזציה, ויש משופרת עבור ניתוח מתחמי חלבון תילקואיד. כאן, אנו מספקים פרוטוקול עדכני מפורט לניתוח של מתחמי חלבון פוטוסינתטיים יציב ואת האינטראקציות שלהם ב תודרנית לבנה.
Introduction
חלבון multisubunit גדולה קומפלקסים photosystem PSII, Cyt b6f ו- ATPase, גם לתאם בייצור של nadph ל ATP בתגובות אור פוטוסינתטיים. ב מהכלורופלסט צמח גבוה, מתחמי ממוקמים ממברנה תילקואיד, אשר הוא מבנה הממברנה הטרוגנית מבחינה מבנית, הכוללת appressed grana משתית הלא-appressed thylakoids. כחול מקורי לזיהוי בג’ל (בסון-עמוד) היא שיטה בשימוש נרחב בניתוח של חלבון multisubunit גדולה מתחמי בצורתם הטבעית, פעילים ביולוגית. השיטה הוקמה עבור ניתוח ממברנה מיטוכונדריאלי חלבון מתחמי1, אך מאוחר יותר הותאם אישית לצורך הקמת מכשול ההפרדה של חלבון מתחמי תילקואיד רשת קרום, או3. השיטה מתאימה (i) לטיהור של מתחמי חלבון תילקואיד בודדים עבור ניתוח מבנה, (ii) לקביעת יליד אינטראקציות בין חלבונים מתחמי ו- (iii) לניתוח של ארגון הכולל מתחמי חלבון בעת שינוי רמזים סביבתיים.
לפני ההפרדה, מתחמי חלבון מבודדים מן הקרום עם חומרי ניקוי nonionic שנבחרו בקפידה, אשר הם קלים בדרך כלל, לשמר את המבנה המקורי של קומפלקסים חלבונים. חומרי ניקוי מכילים הידרופובי, אתרים הידרופיליות, טופס הקזאין יציב מעל ריכוז מסוים, נקרא ריכוז micellar קריטי (CMC). הגדלת ריכוז דטרגנט שמעל תוצאות CMC שיבוש של אינטראקציות השומנים-השומנים, את solubilization של מתחמי חלבון. הבחירה של דטרגנט תלוי על יציבותו של החלבונים עניין את יכולת solubilization של הנוזל. בשימוש שגרתי דטרגנטים כוללים α/β-dodecyl-maltoside digitonin. בעקבות solubilization של חלבון מתחמי במצבם המקורי, חומרים לא מסיסים יוסר על ידי צנטריפוגה. בצמחים גבוה יותר, קרום תילקואיד מאוד נדלנית במבנה, עכורה (למשל, digitonin) solubilize באופן סלקטיבי רק חלק מסוים של קרום3. לכן, כדי לאפיין הארגון מורכבים חלבון או את האינטראקציות בין מתחמי חלבון, זה קריטי תמיד לקבוע את יכולת solubilization של הנוזל שבחרת על-ידי קביעת התכנים כלורופיל, של כלורופיל / b יחס של תגובת שיקוע לאמוד את התשואה והתחום תילקואיד מייצגים (sub), בהתאמה, של השבר solubilized. היחס כלורופיל / b ב- thylakoids שלם של צמחים acclimated צמיחה-אור הוא בדרך כלל בסביבות 3, ואילו קלוא / b הערך של שברים תילקואיד מועשר או grana או stroma thylakoids יורד מתחת (~ 2.5) או חורג (~ 4.5) את הערך של סה כ thylakoids, בהתאמה.
כדי לספק מטען שלילי מתחמי חלבון, Coomassie (CBB) מבריק צבע כחול נוסף מדגם solubilized. בעקבות שינויי תשלום, חלבון מתחמי נודדים לכיוון האנודה ומופרדים על מעבר צבע אקרילאמיד (AA) על פי מסה מולקולרית והצורה שלהם. ברזולוציה גבוהה ויעילה ההפרדה מושגת באמצעות הדרגה ריכוז אקרילאמיד ליניארי. במהלך אלקטרופורזה, מתחמי חלבון נודדים לכיוון האנודה עד שיגיעו למגבלת גודל הנקבוביות שלהם תלוי בגודל. הנקבובית-הגודל של ג’ל לזיהוי תלוי אקרילאמיד הכולל (i) /bis– אקרילאמיד ריכוז (T) ו- (ii) על מחדש bis– אקרילאמיד מונומר ריכוז (ג) ביחס מונומרים סה כ4. לאחר ההפרדה עם בסון-דף, מתחמי חלבון נוסף נחלקים החלבוניות בודדים שלהם על ידי השנייה-מימד (2D) – מרחביות – דף. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת בסון-/ 2D מרחביות עמוד.
Protocol
Representative Results
Discussion
המנגנון המרת אנרגיה פוטוסינתטיים מורכב קומפלקסים גדולים חלבון multisubunit, אשר מוטבעות ממברנה תילקואיד. פרוטוקול זה מתאר שיטה בסיסית לניתוח של מתחמי חלבון תילקואיד צמח מ תודרנית לבנה עם בסון-דף בשילוב עם 2D-מרחביות עמודים. הפרוטוקול מתאים גם לניתוח של תילקואיד מתחמי חלבון מן thylakoids טבק ותר…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מבחינה כלכלית נתמך על ידי האקדמיה של פינלנד (פרוייקט מספרים 307335 ו- 303757) אנרגיה סולארית הסכם גרנט מארי ביומסה (SE2B) הספרותמוזאון (675006). הפרוטוקול מבוסס על התייחסות3.
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
Referencias
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. , 384-394 (1989).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
- Aro, E. -. M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
- Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
- Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
