Intubação oral de Zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção Intestinal de compostos bioativos
Summary
O protocolo descreve intubação zebrafish adulto com um biológico; em seguida, dissecando e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e qPCR. Este método permite a administração de compostos bioativos para monitorar a absorção intestinal e o estímulo imune local evocado. É relevante para a dinâmica intestinal da profilaxia oral de teste.
Abstract
A maioria dos patógenos invadem organismos por meio de sua mucosa. Isto é particularmente verdadeiro em peixe como eles estão continuamente expostos a um ambiente de água rica em microbiana. Desenvolver métodos eficazes para entrega oral de Imunoestimuladores ou vacinas, que ativam o sistema imunológico contra doenças infecciosas, é altamente desejável. Na concepção de ferramentas profiláticas, bons modelos experimentais são necessários para testar seu desempenho. Aqui, nós mostramos um método para intubação oral de zebrafish adulto e um conjunto de procedimentos para dissecar e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e análise (qPCR) reação em cadeia de polimerase quantitativa. Com este protocolo, estamos precisamente pode administrar volumes até 50 µ l de pescar pesando cerca de 1 g simplesmente e rapidamente, sem prejudicar os animais. Este método nos permite explorar a absorção direta na vivo de compostos fluorescente rotulados pela mucosa intestinal e a capacidade de imunomoduladores de tais produtos biológicos no local após a intubação. Combinando métodos a jusante como citometria de fluxo, histologia, qPCR e microscopia confocal do tecido intestinal, podemos entender como Imunoestimuladores ou vacinas são capazes de atravessar as barreiras da mucosa intestinais, passar a lâmina própria, e atingir o músculo, exercendo um efeito sobre o sistema imunológico da mucosa intestinal. O modelo pode ser usado para testar a profilaxia oral candidato e sistemas de entrega ou o efeito local de qualquer composto Bioativo administrado por via oral.
Introduction
O objetivo deste artigo é descrever em profundidade um método simples para intubação oral de zebrafish, juntamente com procedimentos de jusante associados útil. Intubação oral usando zebrafish tornou-se um modelo prático no estudo da dinâmica de doenças infecciosas, vacina oral/imuno-estimulantes, drogas/nanopartículas absorção e eficácia e imunidade da mucosa intestinal. Por exemplo, zebrafish intubação oral tem sido usada no estudo de Mycobacterium marinum e Mycobacterium peregrinum infecção1. Lovmo et al . também utilizado com sucesso este modelo para entregar o trato gastro-intestinal de adultos do zebrafish2-nanopartículas e M. marinum . Além disso, Chen et al costumava intubação oral zebrafish para mostrar que drogas encapsuladas por nanopartículas, quando administrada através do trato gastro-intestinal, foram transportados através do sangue cérebro barreira3. Estes autores realizaram intubação baseada no método descrito por Collymore et al gauvage 4 , com algumas modificações. No entanto, eles não forneceu um protocolo altamente detalhado, descrevendo o procedimento de intubação oral. Aqui, apresentamos um método para intubação oral de adultos do zebrafish baseando Collymore et al 4 outras incluem a preparação do intestino para análise pertinente a jusante por citometria, microscopia confocal e qPCR.
O intestino e particularmente sua mucosa é a primeira linha de defesa contra a infecção e o local principal de absorção de nutrientes5. Quando as células epiteliais e células apresentadoras de antígeno dentro da mucosa barreiras percebem sinais de perigo, uma imediata resposta imune inata é acionada. Em seguida, a resposta imune adaptativa altamente específica é estabelecida por de6,de linfócitos T e B7. Desenvolvimento de vacinas orais é uma área de foco atual em Vacinologia. Essas vacinas seria uma ferramenta eficaz para proteger o organismo em locais expostos devido à resposta específica de células do sistema imunológico em tecidos linfoides associados a mucosa (MALT)8,9. Na aquicultura, vacinas da mucosa tem vantagens óbvias em comparação com as vacinas injetáveis. Eles são práticos para vacinação em massa, menos trabalhosa, são menos estressantes para os peixes e podem ser administrados para peixes jovens. No entanto, candidatos vacinais da mucosa devem chegar o segundo segmento de intestino sem ser desnaturada no meio oral. Eles também devem transpor as barreiras da mucosa para obter acesso a apresentadoras de antígenos (APCs) para induzir respostas locais e/ou sistêmica10de células. Portanto, testes de captação da mucosa alcançada pelo candidato oral antígenos e seus sistemas de entrega, bem como a resposta imune evocada, é essencial no desenvolvimento de vacinas orais.
Em um contexto biomédico, desenvolvendo um modelo para testar os efeitos biológicos de compostos após intubação oral é de interesse crescente. Muitas das características anatômicas e fisiológicas do intestino são conservadas entre linhagens é formado por, com mamíferos e peixes ósseos11. Este modelo de entubação oral ligado à análise a jusante pode ser uma ferramenta para fornecer insights sobre a biologia humana, bem como um campo de testes para produtos biológicos ou outros compostos na vivo.
O protocolo de intubação oral pode ser realizado por um operador, por exemplo, administrar com sucesso até 50 µ l de suspensão de nanopartículas de proteína para peixes pesando 1 g, com uma taxa de sobrevivência de alta. O procedimento é simples de configurar e rápido; 30 peixes podem ser intubados em 1h. O protocolo para a preparação do intestino é a chave para fornecer amostras de células e tecidos de qualidade para posterior análise. Exemplos de resultados a jusante são dados que mostram a utilidade do protocolo na obtenção de dados relacionados à absorção intestinal e no isolamento do RNA de qualidade para qPCR. O protocolo seria de grande utilidade para aqueles que necessitam de um modelo adequado para testar a dinâmica da profilaxia oral ou outros compostos no intestino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo é um aperfeiçoamento da técnica descrita anteriormente para intubação oral por Collymore et al 4 nosso protocolo descreve em detalhes o método de intubação oral e inclui a preparação do intestino para análises a jusante. Nosso método melhora a velocidade de manipulação de peixes permitindo que uma pessoa para executar o protocolo rapidamente, sem muita variação entre os operadores. A principal diferença do nosso protocolo com a anterior é que avaliamos o s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por concessões do Ministério da ciência, espanhol AGAUR fundos para NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER e 2014SGR-345 AGAUR) e Comissão Europeia. RT detém uma bolsa doutorandos de AGAUR (Espanha), JJ foi apoiada por uma bolsa de doutorado do Conselho da bolsa de China (China) e NR é suportado pelo programa de Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Agradecemos o Dr. Torrealba por consultoria especializada na produção de proteína, s. Botelho da “Servei de Microscopia” e Dr. M. Costa desde o “Servei de Citometria” da Universitat Autònoma de Barcelona, para assistência técnica útil.
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
Referencias
- Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
- Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
- Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
- Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
- Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
- Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
- Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biología. 4, 525-539 (2015).
- Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
- Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
- Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
- . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
- Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).
