Summary
Aqui descrevemos um protocolo para visualizar o direcionamento axonal com uma proteína fluorescente em adultas pernas de drosófila por fixação, montagem, imagem e pós-imagem passos.
Abstract
A maioria dos trabalhos na especificação neuronal procedeu-se em genética e fisiologicamente tractable modelos como o C. elegans, Drosophila larvas e peixes, que todos se envolver em movimentos ondulatória (como rastreamento ou natação) como seu principal modo de locomoção. No entanto, uma forma mais sofisticada compreensão da especificação individual do neurônio motor (MN) — pelo menos em termos de informar terapias doença — exige um sistema igualmente tractable que modela melhor os esquemas complexos baseados em apêndice locomoção de vertebrados. O sistema locomotor Drosophila adulto responsável por andar reúne-se todos esses critérios com facilidade, já que neste modelo é possível estudar a especificação de um número pequeno de perna facilmente distinto MNs (aproximadamente 50 MNs por perna) ambos usando um vasto matriz de poderosas ferramentas de genéticas e no contexto de um sistema de locomoção baseada em apêndice fisiológico. Aqui descrevemos um protocolo para visualizar a inervação do músculo de perna em uma mosca adulta.
Introduction
Como o membro de vertebrados, a perna de Drosophila adulta é organizada em segmentos. Cada perna de mosca contém 14 músculos, cada um dos quais compreende várias fibras musculares1,2. Os corpos celulares de MNs a perna adultos estão localizados no T1 (prothoracic), T2 (mesothoracic) e T3 (metathoracic) gânglios em cada lado do cabo ventral do nervo (VNC), uma estrutura análoga à medula espinhal vertebrada (Figura 1). Existem aproximadamente 50 MNs em cada gânglio, cujo objectivo músculos em quatro segmentos da perna ipsilateral (coxa, trocanter, fêmur e tíbia) (Figura 1)3. Importante, cada perna adulta individual MN tem uma identidade única e morfológica que é altamente estereotipada entre animais3,4. Todas essas MNs exclusivos são derivados de 11 células-tronco, chamadas neuroblastos (NBs) produzindo perna MNs durante os estágios larvais de3,4. No final da fase larval todos os imaturos MNs postmitotic diferenciam durante a metamorfose para adquirir seus mandris dendríticas específicos e alvos terminais axonal que definem sua morfologia original3,4. Anteriormente, nós testamos a hipótese de que um código combinatório de factores de transcrição (TFs) especifica a morfologia original de cada perna adulta Drosophila MN5. Como modelo, utilizamos a linhagem B, uma das 11 NB linhagens que produz sete fora os MNs e demonstrou que um código combinatório do TFs expressa na perna adulta postmitotic MNs dita suas morfologias individuais. Por reprograming o código TF de MNs, fomos capazes de alternar as morfologias MN de forma previsível. Chamamos-lhes TFs: MTF (TFs morfológico)5.
Uma das partes mais desafiantes das análises morfológicas dos adultos MNs é Visualizar os axônios através de uma cutícula espessa e autofluorescente com alta resolução. Nós geralmente rotulamos axônios com uma membrana-tag GFP que se expressa no MNs com um sistema de expressão binário, como DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP ou DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, onde DVglut é um forte expressado em motoneurônios6. Combinando estas ferramentas com outras técnicas clonais, como análise de mosaico com um marcador repressible (MARCM)7, cis-MARCM8ou MARCMbow5, nós pode restringir a expressão de GFP de subpopulações de MNs, fazendo a análise fenotípica de axônios mais fácil. Geramos um protocolo a fim de manter a perna morfologia axonal MN intacta para reconstrução 3D de imagens e subsequente, abordando questões específicas intrínsecos na perna de Drosophila adulto tais como (1) fixação das estruturas internas da perna adulta sem afetar a morfologia do axônio, expressão fluorescente endógena e musculatura da perna, (2) montagem da perna para preservar a estrutura geral sob uma lamela e na orientação adequada para processamento para obter a cutícula de imagem da imagem latente e (3) fundo, bem como sinal fluorescente axonal. Embora este protocolo tem sido detalhado para a detecção de expressão fluorescente em axônios MN, pode ser aplicado para visualizar outros componentes da perna neuromusculature em artrópodes.
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Protocol
1. perna dissecção e fixação
- Pegue uma placa de vidro multi bem e preenchimento adequado número de poços com etanol a 70%. Adicionar 15 – 20 CO2-moscas anestesiados (de qualquer sexo e qualquer idade) para cada um bem e usando um pincel, delicadamente dab o voa para a solução de etanol até moscas são totalmente submerso.
Nota: Este passo é remover a hidrofobicidade da cutícula. Não lave por mais de 1 min, porque isto aumenta a autofluorescência da cutícula. - Enxague as moscas 3 vezes com solução de detergente tensoativo não iônico 0,3% em 1x salina tamponada fosfato (PBS). Manter as moscas nesta solução pelo menos 10 min.
Nota: As pernas são fixas melhor quando incluindo detergente, que é susceptível de aumentar a penetração do fixador dentro da perna. - Coloque uma placa multi bem no gelo juntamente com um tubo de paraformaldeído 4% (PFA).
Nota: A preparação do fresco 4% PFA de uma 16% PFA etanol livre solução é essencial. - Use a pinça para remover a cabeça e o abdômen das moscas sem danificar o segmento torácico ou as pernas.
Nota: Remover o abdome torna mais fácil para prender a mosca e dissecar as pernas. - Dissecar as pernas do segmento torácico com pinça e coloque as pernas nos poços contendo 4% PFA. Por isso, empurre suavemente mas com firmeza na junção de coxa-tórax, usando a ponta da pinça fina até a perna desconecta.
- Corrigi as pernas em 4% PFA overnight a 4 ° C (aproximadamente 20 h total).
- Lave as pernas com solução de detergente tensoativo não iônico 0,3% em PBS 1x, x 5 por 20 min cada.
- Substitua o tampão de lavagem por meio de montagem. Mantenha a perna no meio de montagem pelo menos um dia antes da montagem para permitir a sua penetração completa na perna.
Nota: Se o meio de montagem é altamente viscoso, dilua o meio de montagem a 80% com PBS 1x porque a súbita mudança de viscosidade pode causar a cutícula recolher e danificar a estrutura geral da perna. Dependendo do driver Gal4 , moscas podem ser preservadas durante 1 a 3 semanas a 4 ° C, em mídia de montagem até a montagem.
2. perna montagem
- Coloque aproximadamente 20 µ l de glicerol de 70% no lado esquerdo de uma lâmina de microscópio e cobrir com uma lamela de2 quadrado 22 x 22 mm (Figura 2A, B). Pipete cerca de 10 µ l de meio de montagem, ao longo de uma linha paralela a e a uma pequena distância entre a borda direito desta lamela. Adicione outro µ l 30 de meio de montagem mais no lado direito do slide (Figura 2).
Nota: Ao aplicar uma lamela sobre as pernas (veja abaixo) o meio de montagem suavemente se espalhará sob a lamela e em redor das pernas sem deslocando-os. - Usando a pinça fina levante a perna da solução e gentilmente colocá-lo sobre o meio de montagem perto da lamela à esquerda. Faça o mesmo para cada perna e alinhá-los de cima para baixo (Figura 2D).
- Levante-se e transferir as pernas em uma gota de meio realizada entre ambas as pontas da pinça. Orientar as pernas de duas maneiras: lado externo cima ou para baixo.
- Uma vez que todos os pés (até 6-8 pernas podem ser montadas) estão devidamente alinhados, colocar uma segunda lamela sobre as pernas tal que esta lamela ligeiramente repousa sobre a lamela previamente colocada (figura 2E) para permitir o espaço entre a lamínula e o tecido e a Evite que as pernas de ficar danificado (Figura 2).
Nota: Como alternativa, use adesivo poços ou cera ortodôntica para criar espaço entre a lamínula e o slide. - Use um esmalte para assegurar a posição das lamelas em cada canto (Figura 2F).
Nota: O tecido está pronto para a imagem.
3. imagem latente
- Configure uma única faixa usando o laser de 488 nm e dois detectores simultaneamente para obter tanto a fluorescência de GFP e cutícula autofluorescência. Usando o controle de intervalo ou a exibição de controle deslizante na janela espectral da janela do feixe luminoso do software, defina o intervalo de detecção de um detector (detector de 1) entre 498-535 nm e a do outro (detector 2) entre 566-652 nm.
Nota: Normalmente, o detector 1 deve ser um GaAsP e o detector 2 um tubo fotomultiplicador. O canal de 498-535 otimamente detecta sinal GFP, mas também detecta a fluorescência do auto da cutícula. No entanto, o canal de 566 – 652 detecta apenas a fluorescência do auto da cutícula (Figura 3A). - Use um 20 X ou 25 X óleo objectivo de imersão, 1024 x 1024 pixels de resolução, profundidade de 12 bits e definir o espaçamento de Z como 1 µm. pixel Set Habitai tempo como aproximadamente 1,58 µs e média 2 frames/imagem. Use os objectivos com abertura numérica elevada.
- Defina todas as outras configurações, dependendo do microscópio confocal e software da imagem latente a ser utilizado.
- Certifique-se de obter um sinal de cutícula mais brilhante do detector de 566 – 652, em vez do detector de 498-535. Para fazer isso, use a mesma potência do laser do laser-488 para ambos os detectores. Utilizando os marcadores de saturação, regule o ganho do detector 1 para obter um sinal brilhante o suficiente de GFP (Figura 3B, D). Em seguida, ajuste o ganho do detector 2 para garantir que algumas áreas com sinal de alta cutícula (bordas de pernas, articulações) produzem um sinal saturado neste detector (Figura 3, E).
- Se a perna é estendida e muito grande para ser fotografada em um único quadro, use a opção de telha ou posição a partir do software de imagem de microscópio.
- Reconstrua as imagens finais ou usando o microscópio proprietário software de imagem ou usando o ImageJ/FIJI freeware (veja abaixo).
4. pós processamento de imagem
- Abra a pilha confocal no ImageJ/FIJI.
- Use o plugin Bioformats (Plugins | Bio-formatos | Importador de bio-formats) em FIJI para abrir imagens que não estão aqui. Formato TIF do proprietário da imagem latente de pacotes de software9.
- Dividir os canais selecionando imagem | Cor | Separação de canais.
Nota: Se imagens a partir de várias posições foram feitas e devem ser recombinadas, use o emparelhadas costura plugin em FIJI de (Plugins > costura > costura Pairwise)10,11. - Para subtrair o sinal da cutícula do sinal de GFP, abra a calculadora de imagem (processo | Calculadora de imagem): selecione a pilha do detector 1 como 1 imagem (GFP + cutícula) (Figura 4A), na janela de operação Selecione subtraire selecione a pilha do detector 2 como imagem 2 (cutícula) (Figura 4B). Como resultado, apenas o endógeno sinal GFP (GFP) é obtido (Figura 4).
- Mesclar volta esta pilha (GFP), com a pilha 'somente cutícula' Obtida de detector 2 (Figura 4B imagem | Cor | Mesclagem de canais) para obter uma imagem RGB que compreende do sinal GFP de tecido-específica, bem como o sinal de cutícula, que ajuda a identificar os mandris de axônio dentro dos segmentos de perna (Figura 4).
- Ajustar o contraste e brilho de cada imagem (imagem de| Ajustar | Brightness/Contrast) e então gerar uma única imagem RGB (imagem | Tipo | Cor RGB).
Nota: Para gerar uma projeção máxima da pilha-Z (imagem | Pilhas | Projeto Z...), usar a projeção de intensidade máxima para o sinal GFP e intensidade média para a cutícula, que então pode ser ajustada para brilho antes da fusão de dois canais.
- Como alternativa, use uma macro para processamento de imagens em ImageJ/FIJI e subtração automática. Copie o texto em suplementar 1 arquivo no editor de macro (Plugins | Novo | Macro), salve a macro na pasta de Plugins e reiniciar ImageJ/FIJI uma vez para ser capaz de usar a macro.
- Para usar a macro, abra a pilha confocal e abrir a janela de brilho/contraste (imagem | Ajustar | Brightness/Contrast). Em seguida, execute a macro (Plugin | Macro | Executar) e siga as instruções.
- Quando solicitado a especificar a operação (janela de calculadora de imagem), escolha 1 imagem como pilha 1 (GFP), imagem 2 como pilha 2 (cutícula) e subtrair.
Nota: A macro gera uma imagem de projeção máxima do sinal processado GFP (MAX_Result de stack1), uma projeção média da cutícula (AVG_stack2), o resultado da subtração da pilha da pilha de GFP (resultado de stack1) e o não transformados cutícula pilha de cutícula (stack2). - Quando perguntado para ajustar o contraste, use os controles na janela/controle de brilho para ajustar o brilho/contraste da imagem projeção máxima de GFP e da projeção da cutícula, para gerar uma imagem mesclada RGB de ambos os sinais mostrando a GFP em média verde e a cutícula em cinza. Mescle o resultado de stack1 e stack2, para da mesma forma, gerar uma pilha de GFP e cutícula combinada que pode ser usada na próxima fase.
- Para visualizar as pernas em três dimensões, use software 3D especializado com as pilhas recém-gerado (Figura 4E).
- Abrir a pilha RGB com software 3D (ver Tabela de materiais). Na janela de diálogo pop-up, selecione todos os canais na seção modo de conversão e digite o tamanho de um voxel (volume de um pixel).
Nota: Toda a informação necessária está contida nos arquivos de imagem de qualquer software proprietário microscópio sendo usado. - No módulo de canal 2 (sinal GFP), botão direito do mouse e selecione Display | volren. Em seguida, clique no módulo volren. Na seção Propriedades (canto inferior esquerdo da tela) clique esquerdo em Editar e selecione volrengreen.col. No módulo de canal 1 (sinal de cutícula), botão direito do mouse e selecione Display | volren. Em seguida, clique no módulo volren. O seção Propriedades clique em avançado e selecione ddr (uma exposição de radiografia, como transparente), então ajuste o valor de gama para ver o fundo da cutícula (Figura 4E).
- Para gerar uma rotação 3D, botão direito do mouse sobre o módulo de pilha do projeto. Em seguida, selecione animar | rode. Esquerdo, clique em módulo de girar.
- Nas Propriedades de seção clique em usar o bbox center. O módulo de girar com o botão direito e selecione computar | cineasta. No módulo de cineasta clique no botão esquerdo do mouse. Na seção Propriedades clique esquerdo no avançado (superior direito da seção de propriedades).
- No campo nome do arquivo , preencha o nome de rotação do filme. No campo de qualidade escreva 1 (qualidade máxima). Deixar o quadro em 200 se for desejado um rotação s 8.3 (este número pode ser diminuído ou aumentado para modificar a velocidade de rotação). Em seguida, pressione aplicar (botão verde, canto inferior esquerdo da secção de Propriedades (ver vídeo 1)).
- Abrir a pilha RGB com software 3D (ver Tabela de materiais). Na janela de diálogo pop-up, selecione todos os canais na seção modo de conversão e digite o tamanho de um voxel (volume de um pixel).
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Representative Results
Como mostrado na Figura 4, este procedimento permite excelente imagem de axônios GFP-etiquetado em adultas pernas de Drosophila , juntamente com seus terminais mandris. Importante um sinal limpo do GFP é obtido sem qualquer contaminação por fluorescência emitida pela cutícula da perna. O sinal da cutícula então pode ser combinado com o sinal GFP para identificar o posicionamento de axônios nas pernas (Video 1, Figura 1eFigura 4E). Criticamente, é importante obter pés bem fixos. A Figura 5 mostra exemplos de um bem fixo (Figura 5A) e uma perna mal-fixo (Figura 5B). No primeiro caso, as estruturas internas dentro das pernas são de cor uniforme e os tracheas, que são escuros, são visíveis. Um tubo traqueal é executado no centro de cada segmento de perna (adjacente ao tronco principal do nervo) e muitas ramificações mais finas também são visíveis. No último, material escuro está presente no tarso e a tíbia e o sistema traqueal não é claramente visível no fêmur e na coxa: nesses casos sempre observa-se que o sinal de proteínas fluorescentes é degradado, sendo de baixa intensidade ou ausente por completo. Em segundo lugar, cuidadosa dissecação das pernas é necessária para obter todos os segmentos da perna (da coxa ao tibia) e para evitar choques mecânicos nas pernas. Em terceiro lugar, as pernas devem ser deixadas no meio de montagem, o tempo suficiente para penetrar o interior das pernas. Às vezes, segmentos de perna, especialmente o fêmur, aparecem recolhidos — isto pode ser devido à falta de penetração do fixador e/ou o meio de montagem. Finalmente, um deve usar objetivos microscópio de alta qualidade, corrigida para nivelamento do campo e especialmente concebidos para fluorescência e/ou apocromático.
Figura 1: esquema do adulto sistema motor Drosophila perna. Os corpos celulares da perna adulto MNs (verdes) estão localizados no córtex (cinza) do gânglio torácico do VNC. MNs aterraplenar suas dendrites no perna neurópilo (azul) e enviar seus axônios para a perna para inervar dentre os músculos da 14 perna (vermelhos). Note que apenas as pernas de T1 são esquematizadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: procedimento para montar as pernas em corrediças do microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagem procedimento. Espectros de emissão (A) de GFP e da cutícula de perna usando 488 nm argônio laser excitação, obtidos utilizando imagens espectrais de seções de pernas expressando GFP e das pernas da drosófila que não expressam o GFP respectivamente. Nota que as intensidades de fluorescência não tem sido normalizadas, por exemplo, são de dados brutos, usando os mesmos parâmetros (objetivo, montagem de média potência do laser, abertura confocal, ganho, deslocamento) quanto ao procedimento de imagem a perna. Também são mostradas as janelas de detector usadas para imagem latente do GFP + cutícula fluorescência (detector 1: verde) e cutícula (detector 2: rosa), com base nos espectros de fundo de GFP vs cutícula. (B, C) Seção confocal de pernas rotulado com mCD8::GFP sob o controle do DVGlut-Gal4 obtidos de 1 (B) e detector 2 (C). (D, E) Configurações de marcador de saturação usadas para imagem (B, C), respectivamente (ver texto para explicação): azul sem saturação de sinal, vermelho. Observe que no detector 1 as faixas de nervo principal são saturadas, enquanto no detector 2 que algumas regiões da cutícula são saturados (ver setas). Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: processamento de imagens usando o ImageJ/FIJI. (A) Max projeção de pilhas de confocal obtidos de detector de 498-535 nm. (B) projeção máxima da pilha confocal Obtida de detector de 566-652 nm. (C) imagem com apenas sinal GFP obtido subtraindo (A) (B). (D) fundiu-se imagens de (B) e (C). (E) 3-d reconstrução de (C). Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: vista de baixo consumo de energia das pernas dissecadas, mostrando exemplos de fixação (A) e (B). Barra de escala = 200 µm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Video 1: filme de axônios GFP-etiquetado (verdes) junto com a cutícula (cinza) de uma perna Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
A cutícula de Drosophila adulto e de outros artrópodes, que contém muitos pigmentos escuros, é um grande obstáculo para a visualização de estruturas dentro do seu corpo. Além disso, é fortemente fluorescente auto que é agravada pela fixação. Estas duas características são muito problemáticas para observações de corantes fluorescentes ou moléculas dentro do corpo dos animais com um exoesqueleto.
O procedimento que descrevemos e que usamos rotineiramente no laboratório produz imagens limpas e detalhadas de trajetórias de axônio e suas terminações terminal em adultas pernas de Drosophila . Importante um sinal limpo do GFP é obtido sem qualquer contaminação por fluorescência emitida pela cutícula da perna. Esse recurso é obrigatório para poder visualizar e dosar características tridimensionais dos mandris axônio usando programas de geração de imagens 3D. Desta forma podem ser comparados a dados obtidos de várias pernas. O procedimento é facilmente adaptado para observar os sinais de outras proteínas fluorescentes e poderia ser facilmente usado para axônios de imagem em outros artrópodes adultos.
Os dois aspectos críticos do processo são i) obter um forte sinal GFP e ii) a boa fixação das pernas. Para o último rotineiramente obtemos boa fixação, não obstante algumas pernas ocasionalmente não estão fixadas corretamente. Portanto, o procedimento precisa ser melhorado, talvez pela adição de agentes que promovem a penetração dos reagentes (tais como Dimetilsulfóxido), ou outros meios de fixação (fixação de microondas, se preserva fluorescência GFP), mas não exploramos esta possibilidade Além de usar um passo pré-incubação em PBS contendo Triton (que melhorou significativamente a fixação). A fim de obter um bom sinal GFP, usamos um forte condutor de DVglut-Gal4 (também chamado de OK371-Gal4). Também é necessário usar um bom repórter – usamos mCD8-GFP e também obtiveram bons sinais com citoplasmática GFP ou mCherry. Independentemente disso, usamos os repórteres que contêm várias cópias do repórter principal (hexamérica) e várias cópias de sites seguir ou UAS .
Uma limitação deste procedimento é que ele se aplica apenas ao tecido fixo. Estamos atualmente desenvolvendo procedimentos para observações na vivo e está testando várias alternativas (montagem e microscópios). Uma limitação usando microscopia confocal é que é difícil de ver através de toda a perna: isto é porque os sinais das áreas profunda-mente o sinal de GFP é espalhado através do tecido sobrejacente. Alternadamente um microscópio de biphoton permite que a imagem através da espessura de toda a perna.
Finalmente, outros métodos usam tipos diferentes de montagem e fixação de4,12. O significado e a força do nosso procedimento é que uma etapa de subtração separando o verdadeiro sinal GFP de outros sinais (principalmente cuticular) permite excelente reconstrução 3-dimensional e visualização de axônios e seus terminais mandris.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Robert Renard para preparar meio comida de mosca. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de NIH NS070644 para R.S.M e financiamento da ALS Association (#256), FRM (#AJE20170537445) e programa de ATIP-Avenir de J.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22 mm x 22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
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