Visualiseren van Drosophila been Motor Neuron axonen via de volwassen cuticula

Zoals de gewervelde ledematen, is de Drosophila volwassen poot onderverdeeld in segmenten. Elk vliegen been bevat 14 spieren, die bestaat uit meerdere spiervezels^1,2. De organen van de cel van de volwassen been MNs bevinden zich in de T1 (prothoracic), (mesothoracic) T2 en T3 (metathoracic) ganglia aan elke kant van het ventrale zenuw snoer (VNC), een structurele analoog aan het gewervelde ruggenmerg (Figuur 1). Er zijn ongeveer 50 MNs in elke ganglia, welk doel spieren in vier segmenten van de ipsilaterale poot (coxa, trochanter, femur en tibia) (Figuur 1)³. Nog belangrijker is, heeft elke individuele volwassen been MN een unieke morfologische identiteit die is zeer stereotiep tussen dieren^3,4. Alle deze unieke MNs zijn afgeleid van de 11 cellen van de stam, genaamd neuroblasten (NBs) been MNs produceren tijdens de larvale stadia^3,4. Aan het einde van de larvale stadia van alle onderscheiden de onrijpe postmitotic MNs tijdens de metamorfose hun specifieke dendritische arbors en axonale terminal doelen die bepalen van hun unieke morfologie^3,4te verwerven. Eerder testten we de hypothese dat een combinatorische code van transcriptiefactoren (TFs) Hiermee geeft u de unieke morfologie van elk Drosophila volwassen been MN⁵. Als een model, we gebruikten lineage B, één van de 11 NB lineages die zeven van de MNs produceert en aangetoond dat een combinatorische code van TFs uitgedrukt in postmitotic volwassen been MNs dicteert hun individuele morphologies. Door reprograming van de code van de TF van MNs is ons gelukt om over te schakelen van MN morphologies op een voorspelbare wijze. We noemen deze TFs: MTF's (morfologische TFs)⁵.

Een van de meest uitdagende onderdelen van de morfologische analyses van volwassen MNs is het visualiseren van de axonen door middel van een dikke en auto-belichting fluorescerende schubbenlaag met hoge resolutie. We meestal label axonen met een membraan-gelabeld GFP die wordt uitgedrukt in MNs met een binaire expressie systemen, zoals DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP of DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, waar DVglut is een sterke driver uitgedrukt in motoneurons⁶. Door deze hulpmiddelen te combineren met andere klonen technieken zoals mozaïek analyse met een repressible marker (MARCM)⁷, cis-MARCM⁸of MARCMbow⁵, kunnen we de expressie GFP subpopulaties van MNs maken de fenotypische analyse beperken van axonen gemakkelijker. We hebben een protocol gegenereerd zodat been MN axonale morfologie intact voor beeldvorming en de daaropvolgende 3D reconstructie door het aanpakken van specifieke problemen inherent is aan de volwassen Drosophila been zoals (1) fixatie van de interne structuren van de volwassen poot zonder axon morfologie, endogene fluorescerende expressie, en been spieren, (2) montage van de poot voor het behoud van de algehele structuur onder een dekglaasje aan en in de juiste richting voor beeldvorming, en (3) beeldverwerking te verkrijgen van de epidermis achtergrond evenals axonale fluorescent signaal. Terwijl dit protocol heeft voor het opsporen van fluorescerende expressie in MN axonen zijn gedetailleerd, kan het worden toegepast om te visualiseren van andere onderdelen van been neuromusculature bij geleedpotigen.

1. been dissectie en fixatie

1. Neem een multi goed glasplaat en vul de juiste aantal putjes met 70% ethanol. Toevoegen van 15 – 20 CO₂-narcose vliegen (van hetzij geslacht en elke leeftijd) aan elk goed en met behulp van een penseel, zachtjes schar de vliegen in de ethanol oplossing tot vliegen zijn volledig ondergedompeld.
   Opmerking: Deze stap is het verwijderen van de hydrophobicity van de cuticle bestaat. Niet wassen voor meer dan 1 min, want dit auto-fluorescentie van de cuticle bestaat verhoogt.
2. Spoel de vliegen 3 keer met 0,3% nonionic oppervlakteactieve stof schoonmaakmiddel in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Houd de vliegen in deze oplossing voor minstens 10 min.
   Opmerking: Zijn benen beter vast wanneer met inbegrip van wasmiddel, die waarschijnlijk zal toenemen van penetratie van de fixeerspray binnen het been.
3. Plaats een multi goed plaat op het ijs samen met een buis van 4% paraformaldehyde (PFA).
   Opmerking: De voorbereiding van vers 4% PFA van een 16% PFA ethanol gratis stamoplossing is van cruciaal belang.
4. Gebruik pincet te verwijderen van het hoofd en buik van de vliegen zonder beschadiging van het thoracale segment of de benen.
   Opmerking: Het verwijderen van de buik gemakkelijker te houden van de vlieg en het ontleden van de benen.
5. Ontleden van de benen uit het thoracale segment met een tang en plaats de benen in de putjes met 4% PFA. Duw zachtjes maar stevig op de kruising van de coxa-thorax met het puntje van fijne pincet totdat het been los hiervoor.
6. Corrigeer de benen in 4% PFA overnacht bij 4 ° C (ongeveer 20 h totaal).
7. Wassen van de benen met 0,3% nonionic oppervlakteactieve stof schoonmaakmiddel in 1 x PBS, 5 x voor 20 minuten elk.
8. Vervang de buffer wassen met montage medium. Houd het been montage medium voor ten minste een dag voorafgaand aan de montage te maken voor haar volledige penetratie in het been.
   Opmerking: Als het medium van de montage zeer viskeuze is, Verdun de montage middellange tot 80% met 1 x PBS omdat de plotselinge verandering in de viscositeit de cuticle samenvouwen en de algehele structuur van het been schade kan veroorzaken. Afhankelijk van het stuurprogramma Gal4 , kunnen vliegen worden bewaard voor 1 tot 3 weken bij 4 ° C in de montage media tot montage.

2. leg montage

1. Plaats ongeveer 20 µL 70% glycerol aan de linkerkant van een microscoopglaasje en dek met een vierkante 22 x 22 mm² dekglaasje aan (figuur 2A, B). Pipetteer ongeveer 10 µL van montage medium langs een lijn parallel aan en op een kleine afstand van de rechterrand van deze dekglaasje aan. Voeg een andere 30 µL van montage medium verder aan de rechterkant van de dia (figuur 2C).
   Opmerking: Bij de toepassing van een dekglaasje aan over de benen (zie hieronder) het montage medium zal zachtjes verspreid onder het dekglaasje aan en rond de benen zonder hen.
2. Met behulp van fijne pincet heffen van het been van de oplossing en zet het zachtjes op de drager van de montage in de buurt van de linker dekglaasje aan. Doe hetzelfde voor elk been en lijnen van boven naar beneden (figuur 2D).
   1. Heffen en breng de benen in een druppel medium gehouden tussen beide uiteinden van de verlostang. Oriënteren van de benen op twee manieren: externe kant omhoog of omlaag.
3. Zodra alle de benen (max. 6 – 8 benen kunnen worden gemonteerd) op de juiste manier worden uitgelijnd, zet een tweede dekglaasje aan over de benen zodat deze dekglaasje aan iets op het eerder geplaatste dekglaasje aan (figuur 2E berust) te maken voor de ruimte tussen het dekglaasje aan en het weefsel en voorkomen dat de benen van krijgen beschadigd (Figuur 2 g).
   Opmerking: Gebruik als alternatief sticker putten of orthodontische wax om ruimte tussen het dekglaasje aan en de dia te maken.
4. Gebruik een nagellak teneinde de positie van de coverslips op elke hoek (figuur 2F).
   Opmerking: Het weefsel is nu klaar om het imago.

3. beeldvorming

1. Instellen van een track met behulp van de 488 nm laser en twee detectoren tegelijkertijd zowel het GFP fluorescentie en de cuticula auto-fluorescentie te verkrijgen. Met behulp van de controle van het bereik of de schuifregelaar weergave in de spectrale venster van het lichtpad venster van de software, instellen het detectiebereik van één detector (detector 1) tussen 498 – 535 nm en die van de andere (detector 2) tussen 566-652 nm
   Opmerking: Doorgaans de detector 1 moet een detector GaAsP en de detector 2 een fotomultiplicator. Het kanaal van 498-535 optimaal detecteert GFP signaal maar ook detecteert automatisch fluorescentie van de epidermis. Het kanaal van 566-652 detecteert echter alleen de auto fluorescentie van de cuticle (figuur 3A).
2. Gebruikt u een 20 X of 25 X olie onderdompeling doelstelling, resolutie van 1024 x 1024 pixels, 12-bit diepte en Z afstand instellen zoals 1 µm. Set pixel Nadruktijd tijd als ongeveer 1.58 µs en gemiddelde 2 frames/afbeelding. Doelstellingen met hoge numerieke diafragma hanteren.
3. Stel alle andere instellingen, afhankelijk van de confocal microscoop en imaging software wordt gebruikt.
   1. Zorg ervoor om het verkrijgen van een helderder signaal van de epidermis van de detector 566-652 in plaats van de detector van 498 – 535. Om dit te doen, gebruik de dezelfde kracht van de laser van de 488-laser voor beide detectoren. Eerst de winst van de detector 1 te verkrijgen van een helder genoeg GFP-signaal (figuur 3B, D) met behulp van de markers van verzadiging, aanpassen. Pas vervolgens de winst van de detector 2 om ervoor te zorgen dat bepaalde gebieden met hoge cuticula signaal (randen van benen, gewrichten) een verzadigde signaal in deze detector (Figuur 3 c, E produceren).
   2. Als het been is uitgebreid en te groot is om het image worden gemaakt in een enkel frame, optie tegel of positie van de Microscoop denkbaar software.
4. Reconstrueren de laatste beelden hetzij met behulp van de gepatenteerde Microscoop denkbaar software of het gebruik van ImageJ/FIJI freeware (zie hieronder).

4. post Processing Imaging

1. Open de confocal stack in ImageJ/FIJI.
   1. Gebruik de Bioformats-plugin (Plugins | Bio-formaten | Bio-formats-importeur) in FIJI te openen van afbeeldingen die niet in. TIF-formaat van merkgebonden imaging software pakketten⁹.
2. De kanalen splitsen door het selecteren van de afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen.
   Opmerking: Als de beelden vanuit verschillende posities werden gemaakt en moeten worden gerecombineerde, gebruiken de paarsgewijze stiksels plugin in FIJI van (Plugins > Stitching > paarsgewijs Stitching)^10,11.
3. Als u wilt aftrekken van het signaal van de epidermis van het GFP-signaal, open de afbeelding rekenmachine (proces | Afbeelding Calculator): Selecteer de stack in detector 1 als afbeelding 1 (GFP + schubbenlaag) (figuur 4A), selecteer aftrekkenop het operatie-venster en selecteer de stack in detector 2 als afbeelding 2 (schubbenlaag) (figuur 4B). Dientengevolge, wordt alleen het endogene GFP signaal (GFP) (figuur 4C) verkregen.
   1. Samenvoegen terug deze stapel (GFP) met de 'cuticula-only' stack verkregen detector 2 (figuur 4B afbeelding | Kleur | Kanalen verenigen) om een RGB-beeld bestaat uit het weefsel-specifieke GFP signaal evenals de cuticula signaal, dat helpt identificeren van de axon arbors binnen het been segmenten (Figuur 4 d).
   2. Contrast en helderheid van elke image (beeld | Aanpassen | Brightness/Contrast) en genereer vervolgens een één RGB-afbeelding (afbeelding | Type | RGB-kleur).
      Opmerking: Voor het genereren van een maximale projectie van de Z-stack (afbeelding | Stapels | Z Project...), maximale intensiteit projectie gebruiken voor het GFP-signaal en de gemiddelde intensiteit van de epidermis, die vervolgens kan worden aangepast voor helderheid voorafgaand aan het samenvoegen van de twee kanalen.
4. U kunt ook een macro gebruiken voor automatische aftrekken, en de verwerking van beelden in ImageJ/FIJI. Kopieer de tekst in aanvullende bestand 1 in de macro editor (Plugins | Nieuw | Macro), de macro opslaan in de map Plugins en ImageJ/FIJI eenmaal om de macro te kunnen starten.
   1. Als u de macro, open de confocal stack, en open het venster Helderheid/Contrast (Image| Aanpassen | Brightness/Contrast). Daarna de macro uitvoert (Plugin | Macro | Stormloop) en volg de instructies.
   2. Wanneer u wordt gevraagd om op te geven van de werking (afbeeldingsvenster rekenmachine), kies Afbeelding 1 stapel 1 (GFP), afbeelding 2 stapel 2 (schubbenlaag) en aftrekken.
      Opmerking: De macro genereert een maximale projectie-beeld van het verwerkte GFP-signaal (MAX_Result van stack1), een gemiddelde projectie van de cuticle (AVG_stack2), het resultaat van het aftrekken van de stack van de epidermis van het GFP-stack (resultaat van stack1), en de onverwerkte Cuticula stack (stack2).
   3. Wanneer u wordt gevraagd om aan te passen contrast, gebruik de besturingselementen in het venster/helderheid aanpassen van de helderheid/contrast van de afbeelding van de maximale projectie van GFP, en de gemiddelde projectie van de cuticle bestaat, voor het genereren van een RGB-samengevoegde afbeelding van beide signalen waaruit blijkt het GFP in groen en de epidermis in grijs. Samengevoegd resultaat van stack1, en stack2, ook het genereren van een gecombineerde GFP en cuticula stack die kan worden gebruikt in de volgende fase.
5. Om te visualiseren de benen in drie dimensies, door gespecialiseerde 3D software te gebruiken met de nieuw gegenereerde stacks (figuur 4E).
   1. Open de RGB-stack met 3D software (Zie Tabel van materialen). In het pop-up venster, selecteer alle kanalen in de modus conversie sectie en de grootte opgeven van een voxel (deel van een pixel).
      Opmerking: Alle nodige informatie is opgenomen in de afbeeldingsbestanden vanuit welke merkgebonden Microscoop software wordt gebruikt.
   2. Op kanaal 2 module (GFP signaal), klik met de rechtermuisknop en selecteer Display | volren. Klik vervolgens met de linkermuisknop op de volren module. In de sectie eigenschappen (linksonder in het scherm) klikt u op links op bewerken en selecteer volrengreen.col. Op kanaal 1 module (schubbenlaag signaal) met de rechtermuisknop op en selecteer Display | volren. Klik vervolgens met de linkermuisknop op de volren module. In de sectie Properties Klik met de linkermuisknop op Geavanceerd en selecteer ddr (een transparante radiografie-achtige scherm), vervolgens aanpassen de gammawaarde om te zien de cuticula achtergrond (figuur 4E).
   3. Voor het genereren van een 3D-rotatie, klik met de rechtermuisknop op de stapel van de projectmodule. Selecteer vervolgens animeren | draaien. Klik met de linkermuisknop op de draaien module.
   4. In de Eigenschappen sectie Klik op bbox center gebruiken. Op de draaien module met de rechtermuisknop op en selecteer berekenen | film maker. Klik op de film maker -module op de linker mouse button. Klik in de sectie Eigenschappen met de linkermuisknop links op Geavanceerd (rechtsboven van de sectie-eigenschappen).
   5. Vul in het veld bestandsnaam de naam van de rotatie van de film. Schrijf 1 (max kwaliteit) op het gebied van kwaliteit . Frame bij 200 verlaten indien een 8.3 s rotatie is gewenst (dit nummer kan worden verlaagd of verhoogd om te wijzigen van de snelheid van de rotatie). Drukt u vervolgens op toepassen (groene knop, linksonder in de sectie eigenschappen (Zie Video 1)).

Zoals blijkt uit Figuur 4, kunnen deze procedure uitstekende beeldvorming van GFP-geëtiketteerden axonen in volwassen Drosophila benen, samen met hun terminal arbors. Nog belangrijker is wordt een schone GFP-signaal verkregen zonder elke besmetting van de fluorescentie die wordt uitgestraald door de cuticle been. Het signaal van de cuticle kan dan worden gecombineerd met het GFP-signaal om te identificeren de positie van axonen in de benen (figuur 4E, Figuur 1en Video 1). Kritisch, is het belangrijk om goed vaste poten. Figuur 5 ziet u voorbeelden van een goed vast (figuur 5A) en een slecht-vaste been (figuur 5B). In het eerste geval zijn de interne structuren binnen de benen van een effen kleur en de tracheas, die donker zijn, worden weergegeven. Een belangrijkste tracheale buis loopt in het midden van elk been segment (grenzend aan de belangrijkste stam van de zenuw) en veel dunner gevolgen zijn ook zichtbaar. In het laatste, donker materiaal is aanwezig in de Voetwortel en onderbeen en de tracheale systeem is niet duidelijk zichtbaar in het bovenbeen en coxa: in dergelijke gevallen is het altijd waargenomen dat het signaal van fluorescente proteïnen is gedegradeerd met een geringe intensiteit of afwezige helemaal. Tweede, zorgvuldige dissectie van de benen is noodzakelijk om alle segmenten van het been (vanaf coxa tot tibia) en om te voorkomen dat de mechanische schok aan de benen. Ten derde moeten de benen worden overgelaten in montage medium lang genoeg om te penetreren van de binnenkant van de benen. Soms been segmenten, met name het dijbeen, samengevouwen weergegeven — dit kan te wijten zijn aan gebrek aan penetratie van de fixeer en/of montage medium. Tot slot moet men gebruik maken van hoge kwaliteit Microscoop doelstellingen, gecorrigeerd voor de vlakheid van veld en speciaal ontworpen voor fluorescentie en/of apochromatische.

Figuur 1: Schema van het locomotorisch stelsel van volwassen Drosophila been. De organen van de cel van de volwassen poot MNs (groen) zijn gelokaliseerd in de cortex (grijs) van de thoracale ganglion van de VNC. MNs arborize hun dendrites in de been-neuropil (blauw) en sturen hun axonen in de etappe naar innervate een van de 14 beenspieren (rood). Opmerking dat alleen de T1 benen zijn geschematiseerde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: Procedure te monteren benen op Microscoop dia. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Imaging procedure. (A) emissie spectra van GFP en been cuticula met behulp van 488 nm Argon laser excitatie, verkregen met behulp van spectrale imaging van secties van de benen GFP uitdrukken en benen van Drosophila die niet GFP respectievelijk uitdrukken doen. Merk op dat de intensiteit van de fluorescentie hebben niet genormaliseerd zijn, zijn bijvoorbeeld, van ruwe gegevens met behulp van dezelfde parameters (doelstelling, medium, laser macht, confocal diafragma, winst, offset montage) wat betreft het been imaging procedure. Ook te zien zijn de ramen van de detector gebruikt voor imaging-de GFP + cuticula fluorescentie (detector 1: groen) en cuticula (detector 2: roze), gebaseerd op de GFP vs cuticula achtergrond spectra. (B, C) Confocale gedeelte van de benen met mCD8::GFP onder de controle van DVGlut-Gal4 het label verkregen detector 1 (B) en detector 2 (C). (D, E) Verzadiging marker instellingen voor beeld (B, C) respectievelijk (zie tekst voor uitleg): blauwe geen signaal, rode verzadiging. Merk op dat op detector 1 de belangrijkste zenuw tracks zijn verzadigd, terwijl op de detector 2 die sommige regio's van de cuticle bestaat zijn verzadigd (Zie pijlen). Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: verwerking van afbeeldingen met behulp van ImageJ/FIJI. (A) maximale projectie van de confocal stapels verkregen 498-535 nm detector. (B) Max projectie van de confocal stack verkregen 566-652 nm detector. (C) Image met slechts GFP signaal verkregen door af te trekken (A) vanaf (B). (D) samengevoegd beelden van (B) en (C). (E) 3D-reconstructie van (C). Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: Low-power weergave van ontleed benen waarin voorbeelden van goede (A) en slechte (B) fixatie. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Video 1: film van GFP-geëtiketteerden axonen (groen) samen met de cuticula (grijs) van een leg. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

De schubbenlaag van volwassen Drosophila en andere geleedpotigen, waarin vele donkere pigmenten, is een groot obstakel voor het bekijken van de structuren in hun lichaam. Het is bovendien sterk auto TL, die wordt verergerd door fixatie. Deze twee functies zijn zeer problematisch voor waarnemingen van fluorescente kleurstoffen of moleculen in het lichaam van dieren met een exoskelet.

De procedure die we hebben beschreven en die we regelmatig gebruiken in het lab levert schoon en gedetailleerde beelden van axon trajecten en van hun terminal uitgangen in volwassen Drosophila benen. Nog belangrijker is wordt een schone GFP-signaal verkregen zonder elke besmetting van de fluorescentie die wordt uitgestraald door de cuticle been. Deze functie is verplicht om te kunnen visualiseren en kwantificeren van driedimensionale functies van axon arbors met behulp van 3D-imaging programma's. Op deze manier kan de gegevens die zijn verkregen uit verschillende benen worden vergeleken. De procedure is eenvoudig aangepast voor het waarnemen van signalen van andere fluorescente proteïnen en gemakkelijk kan worden gebruikt om de afbeelding axonen in andere volwassen geleedpotigen.

De twee essentiële aspecten van de procedure zijn i) te verkrijgen van een sterke GFP signaal, en ii) juiste fixatie van de benen. Voor de laatste routinematig krijgen we goede fixatie, niettemin sommige benen zijn af en toe niet vast goed. Daarom de procedure moet worden verbeterd, misschien door agenten ter bevordering van de penetratie van de reagentia (zoals dimethylsulfoxide), of op andere wijze van fixatie (magnetron fixatie, als het behoudt GFP fluorescentie) toe te voegen, maar we hebben deze mogelijkheid niet onderzocht Afgezien van het gebruik van een preïncubatiemethode stap in PBS met Triton (die aanzienlijk verbeterd fixatie). Om een goed signaal GFP gebruiken we een sterke DVglut-Gal4 -stuurprogramma (ook genoemd OK371-Gal4). Het is ook nodig om een goede verslaggever-we gebruiken mCD8-GFP en ook goed signalen met cytoplasmatische GFP of mCherry hebben gekregen. Hoe dan ook, we gebruiken verslaggevers die verscheidene exemplaren van de primaire verslaggever (hexameer) en meerdere kopieën van LexO of UAS sites bevatten.

Een beperking van deze procedure is dat het alleen van toepassing op vaste weefsel. Wij zijn momenteel de ontwikkeling van procedures voor in vivo waarnemingen en zijn het testen van verschillende alternatieven (montage en microscopen). Een beperking met behulp van de confocal microscopie is dat het moeilijk is te bekijken via het hele been: Dit komt doordat voor signalen uit diep gelegen gebieden is het signaal van GFP verspreid door het bovenliggende weefsel. Een biphoton Microscoop kunt afwisselend beeldvorming door de dikte van het hele been.

Ten slotte, andere methoden gebruiken verschillende soorten montage en fixatie van de^4,12. De betekenis en kracht van onze procedure is dat een stap van de aftrekken voor het scheiden van ware GFP signaal van andere (voornamelijk cuticular) signalen kunt uitstekende 3-dimensionale reconstructie en visualisatie van axonen en hun terminal arbors.