Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo ao cálcio imagem sinalização em populações de tipos de células individuais na junção neuromuscular murino.
Abstract
A atividade elétrica das células em tecidos pode ser monitorizada por técnicas eletrofisiológicas, mas estas geralmente limitam-se a análise de células individuais. Desde que um aumento de cálcio intracelular (Ca2 +) no citosol ocorre muitas vezes devido à atividade elétrica, ou em resposta a uma miríade de outros estímulos, esse processo pode ser monitorado pela imagem de células carregado com sensíveis ao cálcio fluorescente corantes. No entanto, é difícil esta resposta em um tipo de célula individual dentro de todo tecido da imagem porque estas tinturas são aceites por todos os tipos de células dentro do tecido. Em contraste, os indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIs) podem ser expressa por um tipo de célula individual e fluorescem em resposta a um aumento de intracelular Ca2 +, permitindo assim a imagem de Ca2 + sinalização em populações inteiras de tipos de células individuais. Aqui, nós aplicamos o uso do GECIs GCaMP3/6 até a junção neuromuscular do mouse, uma sinapse tripartida entre os neurônios motores, músculo esquelético e terminal/perisynaptic células de Schwann. Vamos demonstrar a utilidade desta técnica em preparações do tecido clássico ex vivo . Usando um divisor ótico, realizamos imagem dual-comprimento de onda de Ca2 + sinais dinâmicos e um rótulo estático da junção neuromuscular (JNM) em uma abordagem que poderia ser facilmente adaptada para monitorar duas células específicas Lino ou tensão geneticamente codificado indicadores (GEVI) simultaneamente. Finalmente, discutimos as rotinas usadas para capturar espacial de mapas de intensidade de fluorescência. Juntas, estas técnicas ópticas, transgênicas e analíticas podem ser empregadas para estudar a atividade biológica das subpopulações de células distintas para o MNJ em uma ampla variedade de contextos.
Introduction
O MNJ, como todas as sinapses, é composto por três elementos: um terminal pré-sináptica derivado de um neurônio, uma célula neurônio pós-sináptico/efetoras, e um perisynaptic glia celular1,2. Enquanto os aspectos básicos de transmissão sináptica primeiro foram demonstrados neste de sinapse3, muitos aspectos deste processo permanecem desconhecidos, em parte devido a expressão das mesmas moléculas por elementos celulares distintas desta sinapse. Por exemplo, os receptores de ambos os nucleotídeos de adenina Purina ATP e acetilcolina (ACh), que são co liberados por neurônios motores no MNJ vertebrado, são expressos por músculo, células de Schwann e neurônios motores, complicando, assim, a interpretação de qualquer efeito funcional exercido por estas substâncias (por exemplo, liberação de transmissor ou resposta, geração de força muscular)4. Além disso, embora os componentes tripartites o MNJ são simples em comparação com, por exemplo, os neurônios no sistema nervoso central que muitas vezes apresentam múltiplas entradas sinápticas, se os neurônios motores, células musculares ou células de Schwann variam em resposta a estímulos com base na sua intrínseca heterogeneidade (por exemplo, derivação embrionária, subtipo de fibra, morfologia) não é clara. A fim de abordar cada uma destas questões, seria vantajoso para controlar simultaneamente a resposta de muitas células dentro de um elemento sináptico, bem como faixa, ao mesmo tempo, essa resposta em qualquer um dos outros elementos separados. Estratégias convencionais usando corantes químicos para medir a sinalização de cálcio não podem atingir esses dois objetivos, porque banho-aplicado tintura é retomada por vários tipos de células após a aplicação de tecido e intracelular carregado da tintura só pode ser usada para Visualizar individuais ou pequenas divisões de células. Aqui, utilizar ratos transgênicos expressando GECIs projetado para medir a célula específica cálcio sinalização, juntamente com imagens específicas e ferramentas de software5, demonstramos o primeiro destes dois objectivos globais e discutir como a adição de novos ferramentas de transgénicas ajudaria a alcançar o segundo. Esta técnica será útil para qualquer pessoa interessada em acompanhar a dinâmica de cálcio ou outro celular sinalização observáveis de eventos através de sensores ópticos gene codificado em várias populações de células ao mesmo tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós fornecemos alguns exemplos de Ca2 + respostas em células específicas no tecido neuromuscular intacto, usando ratos Lino-expressando de medição. Para executar com êxito estes experimentos, é imperativo para não machucar o nervo frênico durante a dissecção. ParaCa 2 + respostas nas células de Schwann em baixa ou alta potência (ou seja, 20 X ou 60 X) de imagem, é necessário usar BHC ou µ-conotoxina ao movimento do bloco. Para imagens de baixo consumo de energia de Ca<s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado com fundos de institutos nacionais de saúde (NIH) GM103554 e GM110767 a (T.W.G.) e do centro nacional de pesquisa recursos 5P20RR018751 e o Instituto Nacional de ciências médicas de geral 8P 20 GM103513 (para G.W.H.).
Materials
| Myf5-Cre mice | Jax | #007893 | Drives muscle cell expression as early as E136 |
| Wnt1-Cre mice | Jax | #003829 | Drives expression into all Schwann cells at E13 but not P209 |
| Sox10-Cre mice | Jax | #025807 | Drives Schwann cell expression at older ages |
| Conditional GCaMP3 mice | Jax | #029043 | Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion |
| Conditional GCaMP6f mice | Jax | #024105 | Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins |
| Minutien pins (0.1mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel |
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon | MBA74100 | Allows staging and observation of specimen |
| Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator | Autom8 | MXMScr | Allows movement of specimen |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | Holds recording and stimulating electrodes |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording |
| Microelectrode low-noise data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1550 | Allows electrophysiological data acquisition |
| Microelectrode data analysis system | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Performs electrophysiological data analysis |
| Square wave stimulator | Grass | S48 | Stimulates nerve to excite muscle |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduces stimulation artifacts |
| Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impales and records nerve-evoked muscle potentials |
| Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter | Sutter | BF150-117-15 | Lengthened and used for suction electrode |
| Micropipette Puller | Sutter | P-97 | Pulls and prepares recording electrodes |
| 1200×1200 pixel, back-illuminated cMOS camera | Photometrics | Prime 95b | Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging |
| Light Source | Lumencor | Spectra X | Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation |
| Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Provide long working distances for visualization of specimen |
| Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp | Sumita | LS-DWL-N | Provides illumination for brightfield observation |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 and 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Permits dual band imaging |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25×36 | Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging |
| Imaging data acquisition system | Nikon | NIS Elements – MQS31000 | Allows imaging data acquisition |
| Wavelength control module | Nikon | MQS41220 | Module for imaging data acqusiition |
| Emission splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module for imaging data acqusiition |
| Imaging data analysis system | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data |
Referencias
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