Summary

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

Published: October 04, 2018
doi:

Summary

여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.

Abstract

Electrophysiological 기법에 의해 조직에 있는 세포의 전기적 활동을 모니터링할 수 있습니다 있지만 이들은 일반적으로 개별 셀의 분석을 제한. 셀의 이미징 형광 칼슘-민감한 로드 이후는 cytosol에서 세포내 칼슘 (캘리포니아2 +)의 증가 종종 전기 활동 때문에 발생 합니다 또는 다른 자극의 무수에 응답,이 프로세스에 의해 모니터링 수 있습니다. 염료입니다.  그러나, 그것은이 염료는 조직 내의 모든 세포 유형에 의해 채택 하기 때문에 전체 조직 내에서 개별 셀 형식에서이 응답을 이미지 어렵다. 반면, 유전자 인코딩된 칼슘 지표 (GECIs)는 개별 셀 형식에 의해 표현 될 수 있습니다 및 세포내 캘리포니아2 +, 따라서 허용의 캘리포니아2 + 의 전체 인구에 있는 신호 이미징의 증가에 대 한 응답 형광 개별 셀 종류입니다. 여기, 우리는 마우스 신경 근육 학 교차로 적용할 GECIs GCaMP3/6의 사용, 모터 신경, 골격 근육, 및 터미널/perisynaptic 사이 3 자간 냅 Schwann 세포. 조직 준비 클래식 비보 전 에이 기법의 유틸리티를 설명합니다. 광 스플리터를 사용 하 여, 우리 수행 동적 캘리포니아2 + 신호 듀얼-파장 이미징 및 신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 정적 레이블 두 셀 전용 GECI 또는 유전자 인코딩된 전압 모니터링을 쉽게 적용할 수 있는 방법을 지표 (GEVI) 동시에. 마지막으로, 우리는 형광 강도의 공간 지도 캡처하는 데 사용 하는 루틴을 논의. 함께, 이러한 광학, 유전자 변형, 그리고 분석 기술은 공부를 다양 한 문맥에서에서 NMJ에 뚜렷한 세포 모집단의 생물 학적 활동을 사용할 수 있습니다.

Introduction

모든 시 냅 스 처럼 NMJ 3 요소의 구성: 터미널 연 접 신경 postsynaptic 신경/이펙터 셀에서에서 파생 하 고 perisynaptic glial 세포1,2. 시 냅 시스 전송의 기본적인 측면 처음이 시 냅 스3에서 설명 되었다, 하는 동안이 프로세스의 여러 측면,이 시 냅이 스의 고유 셀룰러 요소에 의해 동일한 분자의 표현 때문에 부분에서 알 수 없는 남아 있습니다. 예를 들어 모터 뉴런 척추 NMJ에 의해 공동 출시 되는 퓨 린 아데닌 뉴클레오티드 ATP와 아 세 틸 콜린 (ACh) 수용 체 근육, Schwann 세포, 모터 신경, 따라서 복잡의 해석에 의해 표현 됩니다. 이러한 물질 (예를 들어, 송신기 릴리스 또는 응답, 근육 힘 세대)4에 의해 발휘 하는 기능 효과. 또한,는 NMJ의 같은 구성 요소는 간단한에 비해, 예를 들어 신경 중앙 신경 조직에 여러 개의 시 냅 스 입력, 수시로 전시 하는 모터 신경 세포, 근육 세포, 또는 Schwann 세포 다를 기반으로 하는 자극에 대 한 응답 여부 그들의 내장에 (예를 들어, 배아 파생, 섬유 하위, 형태학)이 명확 하지 않다. 각 이러한 문제를 해결 하기 위해 그것은 동시에 같은 시간, 같은 다른 별도 요소 중 하나에 응답에 트랙 뿐만 아니라 한 시 냅 스 요소 내의 많은 세포의 응답을 추적 하는 것입니다. 칼슘 신호 측정 화학 염료를 사용 하 여 기존의 전략 목욕 적용 염료 조직으로, 신청 후 여러 셀 유형에 의해 채택 되 고 침 로드 염료 시각화에 사용할 수 있기 때문에이 두 가지 목표를 달성할 수 없는 셀의 개인 또는 작은 동료 여기, 휴대 전용 칼슘 신호, 특정 영상 및 소프트웨어 도구5, 우리는이 두 가지 전반적인 목표의 처음을 설명 하 고 토론을 측정 하도록 설계 GECIs를 표현 하는 유전자 변형 쥐를 이용 하 여 어떻게의 새로운 유전자 변형 도구 두 번째 달성 도움이 될. 이 기술은 추적 칼슘 역학 또는 동시에 여러 세포 인구에서 유전자 인코딩 광학 센서를 통해 이벤트 관찰할 신호 다른 세포에 관심이 사람에 대 한 유용할 것 이다.

Protocol

축산 및 실험 치료 및 실험 동물의 사용 및 네바다의 대학에 IACUC 국가 학회 건강 가이드에 따라 수행 했다. 1. 격 막 및 유전자 변형 쥐에서 인할지 신경의 준비 유전자 변형 쥐와 유전자 형을 oligonucleotide 뇌관 이러한 마우스 구입.참고: 뇌관은 이러한 쥐의 각에 대 한 “정보” 페이지에 표시 됩니다. Cre 드라이버 대립 유전자 변형/노크-에서 적절 한 1 부와 조건부…

Representative Results

형광 강도 변화, 세포내 캘리포니아2 + , NMJ의 정의 된 세포 유형 내에서 증가 의해 중재의 몇 가지 예는이 접근의 유틸리티 표시. 이러한 결과 응답 셀의 위치 뿐만 아니라 셀 수 응답 및 얼마나 많은 각 셀에 특정 응답의 평가 되므로 그들의 반응의 강도 제공 하는 공간 형광 강도 지도 제시 자극입니다. 예를 들어 그림 1에서 보듯이, 우리의 ?…

Discussion

여기 우리는 측정 캘리포니아2 + 그대로 신경 근육 학 조직 GECI 표현 하는 마우스를 사용 하 여 특정 셀에 응답의 몇 가지 예제를 제공 합니다. 이러한 실험을 성공적으로 수행 하려면 인할지 신경 해 부 동안에 상처를 하지 필수적입니다. 캘리포니아2 + 응답 Schwann 세포 낮은 또는 높은 전력 (, 20 X 또는 X 60)에, 이미지를 제너 시스 또는 µ-conotoxin 블록에 사용할 필요가 있다. …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 자금 및 연구 자원 5P20RR018751에 대 한 국립 센터 및 국립 연구소의 종합 의료 과학 8 P 20 GM103513 (G.W.H.)에 건강 (NIH) GM103554 및 GM110767 (T.W.G.)에 국립 보건원에서 지원 되었다.

Materials

Myf5-Cre mice Jax #007893 Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice Jax #003829 Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice Jax #025807 Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice Jax #029043 Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice Jax #024105 Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) Hit2Lead #5102862 Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX Biotium #00007 Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb Peptides Int'l #CONO20-01000 Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard Ellswoth Adhesives # Sil Dielec Gel .9KG  Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter) Fine Science Tools 26002-10 Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope  Nikon MBA74100 Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator  Autom8 MXMScr Allows movement of specimen
Manual micromanipulator  Narishige M-152 Holds recording and stimulating electrodes 
Microelectrode amplifier  Molecular Devices Axoclamp 900A Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system Molecular Devices Digidata 1550  Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system Molecular Devices PCLAMP 10 Standard Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator Grass S48 Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit Grass PSIU6 Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter  Sutter FG-GBF100-50-15 Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter  Sutter BF150-117-15 Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller Sutter P-97  Pulls and prepares recording electrodes
1200×1200 pixel, back-illuminated cMOS camera  Photometrics Prime 95b Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source Lumencor Spectra X Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
 Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm  Nikon CFI60 Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp Sumita LS-DWL-N Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter  Hamamatsu A12801-01 Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)  SemRock FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter Sem Rock FF560-FDi01-25×36 Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system Nikon NIS Elements – MQS31000 Allows imaging data acquisition
Wavelength control module Nikon MQS41220 Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module  Nikon MQS41410 Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system NA Volumetry 8D5, Fiji Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data

Referencias

  1. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
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Heredia, D. J., Hennig, G. W., Gould, T. W. Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm. J. Vis. Exp. (140), e58347, doi:10.3791/58347 (2018).

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