Ex Vivo Imagerie du Calcium cellulaire spécifique de signalisation à la Synapse Tripartite du diaphragme souris
Summary
Nous présentons ici un protocole au calcium image de signalisation dans les populations de types de cellules individuelles à la jonction neuromusculaire murine.
Abstract
L’activité électrique des cellules dans les tissus peut être surveillée par des techniques électrophysiologiques, mais ceux-ci sont généralement limités à l’analyse des cellules individuelles. Puisqu’une augmentation du calcium intracellulaire (Ca2 +) dans le cytosol se produit souvent en raison de l’activité électrique, ou en réponse à une myriade d’autres stimuli, ce processus peut être surveillé par l’imagerie de cellules chargé avec fluorescentes sensibles au calcium colorants. Toutefois, il est difficile d’imager cette réponse en un type de cellule individuelle au sein de tissus entiers parce que ces colorants sont repris par tous les types de cellules dans les tissus. En revanche, les indicateurs de calcium génétiquement encodé (GECIs) peuvent être exprimées par un type de cellule individuelle et sont fluorescents en réponse à une augmentation du Ca intracellulaire2 +, ce qui permet l’imagerie de Ca2 + signalisation des populations entières de types de cellules individuelles. Ici, nous appliquons l’utilisation du GECIs GCaMP3/6 à la jonction neuromusculaire de la souris, une synapse tripartite entre les motoneurones du muscle squelettique et terminal/périsynaptique les cellules de Schwann. Nous démontrent l’utilité de cette technique dans les préparations de tissu classique ex vivo . À l’aide d’un diviseur optique, nous réalisons l’imagerie double longueur d’onde des signaux dynamiques de Ca2 + et une étiquette statique de la jonction neuromusculaire (NMJ) dans une approche qui pourrait être facilement adaptée pour surveiller deux GECI spécifiques des cellules ou tension génétiquement encodée indicateurs (GEVI) simultanément. Finalement, nous discutons les routines utilisées pour capturer des cartes spatiales de l’intensité de la fluorescence. Ensemble, ces techniques optiques, transgéniques et analytiques peuvent être utilisées pour étudier l’activité biologique des sous-populations de cellules distinctes à la NMJ dans une grande variété de contextes.
Introduction
Le NMJ, comme toutes les synapses, se compose de trois éléments : une terminaison présynaptique dérivé d’un neurone, une cellule de neurone postsynaptique/effecteurs, et un périsynaptique glial cell1,2. Alors que les aspects fondamentaux de la transmission synaptique étaient tout d’abord montrés à cette synapse3, beaucoup d’aspects de ce processus demeure inconnus, en partie en raison de l’expression des molécules de mêmes par les éléments cellulaires distincts de cette synapse. Par exemple, des récepteurs pour les séquences de nucléotides puriques adénine ATP et l’acétylcholine (ACh), qui sont conjointement libérées par les neurones moteurs à la NMJ vertébré, sont exprimés par muscle, les cellules de Schwann et les neurones moteurs, ce qui complique l’interprétation de le quelconque effet fonctionnel exercée par ces substances (p. ex., libération des transmetteurs ou réponse, génération de la force musculaire)4. En outre, bien que les composants tripartites de la NMJ sont simples par rapport à, par exemple, les neurones du système nerveux central qui présentent souvent des entrées synaptiques multiples, si les motoneurones, les cellules musculaires ou des cellules de Schwann varient en réponse à des stimuli basé sur leur intrinsèque hétérogénéité (p. ex., dérivation embryonnaire, sous-type de fibre, morphologie) n’est pas claire. Afin de répondre à chacune de ces questions, il serait avantageux de suivre simultanément la réponse de plusieurs cellules dans un seul élément synaptique, ainsi que piste, en même temps, une telle réponse dans un des autres éléments distincts. Les stratégies conventionnelles utilisant des teintures chimiques pour mesurer la signalisation calcique ne peut pas atteindre ces deux buts, car appliqué au bain de teinture est repris par plusieurs types de cellules après application sur tissu, et utilisable uniquement dans les cellules chargées de colorant pour visualiser individuels ou de petites cohortes de cellules. Ici, utilisant des souris transgéniques exprimant GECIs conçu pour mesurer la signalisation calcique spécifique des cellules, ainsi que l’imagerie spécifique et logiciels outils5, nous montrer la première de ces deux objectifs généraux et discuter comment l’ajout de nouveaux outils transgéniques permettrait d’atteindre le second. Cette technique sera utile pour tous ceux intéressés par le suivi dynamique du calcium ou autres cellulaires observables d’événements de signalisation par l’intermédiaire de capteurs optiques gène codé dans plusieurs populations de cellules en même temps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous fournissons ici quelques exemples de mesure Ca2 + réponses dans certaines cellules dans le tissu neuromusculaire intact, à l’aide de souris exprimant le GECI. Pour réaliser ces expériences, il est impératif de ne pas blesser le nerf phrénique au cours de la dissection. Pour image réponses Ca2 + dans les cellules de Schwann à haute ou basse puissance (c’est-à-dire, 20 X ou 60 X), il est nécessaire d’utiliser le BHC ou µ-conotoxine au mouvement du bloc. Pour l’imagerie d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu avec des fonds des National Institutes of Health (NIH) GM103554 et GM110767 à (T.W.G.) et le National Center for Research Resources 5P20RR018751 et le National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (pour G.W.H.).
Materials
| Myf5-Cre mice | Jax | #007893 | Drives muscle cell expression as early as E136 |
| Wnt1-Cre mice | Jax | #003829 | Drives expression into all Schwann cells at E13 but not P209 |
| Sox10-Cre mice | Jax | #025807 | Drives Schwann cell expression at older ages |
| Conditional GCaMP3 mice | Jax | #029043 | Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion |
| Conditional GCaMP6f mice | Jax | #024105 | Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins |
| Minutien pins (0.1mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel |
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon | MBA74100 | Allows staging and observation of specimen |
| Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator | Autom8 | MXMScr | Allows movement of specimen |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | Holds recording and stimulating electrodes |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording |
| Microelectrode low-noise data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1550 | Allows electrophysiological data acquisition |
| Microelectrode data analysis system | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Performs electrophysiological data analysis |
| Square wave stimulator | Grass | S48 | Stimulates nerve to excite muscle |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduces stimulation artifacts |
| Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impales and records nerve-evoked muscle potentials |
| Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter | Sutter | BF150-117-15 | Lengthened and used for suction electrode |
| Micropipette Puller | Sutter | P-97 | Pulls and prepares recording electrodes |
| 1200×1200 pixel, back-illuminated cMOS camera | Photometrics | Prime 95b | Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging |
| Light Source | Lumencor | Spectra X | Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation |
| Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Provide long working distances for visualization of specimen |
| Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp | Sumita | LS-DWL-N | Provides illumination for brightfield observation |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 and 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Permits dual band imaging |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25×36 | Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging |
| Imaging data acquisition system | Nikon | NIS Elements – MQS31000 | Allows imaging data acquisition |
| Wavelength control module | Nikon | MQS41220 | Module for imaging data acqusiition |
| Emission splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module for imaging data acqusiition |
| Imaging data analysis system | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data |
Referencias
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