In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali
Summary
Presentiamo un in vivo imaging protocol per la corteccia cerebrale di topi neonatali di imaging due fotoni. Questo metodo è adatto per analizzare la dinamica dello sviluppo dei neuroni corticali, i meccanismi molecolari che controllano le dinamiche neuronali e i cambiamenti nella dinamica neuronale in modelli di malattia.
Abstract
Imaging del due-fotone è un potente strumento per l’analisi in vivo di circuiti neuronali nel cervello dei mammiferi. Tuttavia, un numero limitato di metodi di imaging in vivo esiste per l’esame del tessuto di cervello di mammiferi neonati dal vivo. Qui riassumiamo un protocollo per l’imaging di singoli neuroni corticali in topi neonatali vivente. Questo protocollo comprende le seguenti due metodologie: (1) il sistema di Supernova per radi e luminosi etichettatura dei neuroni corticali nel cervello in via di sviluppo e (2) una procedura chirurgica per il fragile cranio neonatale. Questo protocollo permette l’osservazione dei cambiamenti temporali dei singoli neurites corticali durante fasi neonatale con un elevato rapporto segnale-rumore. Con etichetta cellula-specifico del silenziamento genico e knockout può essere ottenute anche combinando la Supernova con gene CRISPR/Cas9 sistemi di editing e di interferenza del RNA. Questo protocollo può, quindi, essere utilizzato per analizzare la dinamica dello sviluppo dei neuroni corticali, meccanismi molecolari che controllano la dinamica neuronale e cambiamenti nella dinamica neuronale in modelli di malattia.
Introduction
Il cablaggio preciso di circuiti neuronali nella corteccia cerebrale è essenziale per le funzioni cerebrali superiori tra cui percezione, cognizione e apprendimento e memoria. Circuiti corticali sono dinamicamente raffinati durante lo sviluppo postnatale. Studi hanno studiato il processo di utilizzo di circuito corticale formazione istologica e analisi di coltura in vitro . Tuttavia, le dinamiche di formazione del circuito in mammiferi viventi sono rimasta per lo più inesplorata.
Microscopia del due-fotone è stato ampiamente utilizzata per le analisi in vivo di circuiti neuronali al cervello di topo adulto1,2. Tuttavia, a causa di problemi tecnici, solo un limitato numero di studi hanno affrontato la formazione di circuiti neuronali in topi neonati. Ad esempio, Carrillo et al. eseguita l’imaging time-lapse di arrampicata fibre nel cervelletto in seconda settimana postnatale3. Portera-Cailliau et al ha segnalato l’imaging degli assoni in strato corticale 1 nel primo postnatale settimana4. Nello studio presente, riassumiamo un protocollo per l’osservazione dei neuroni corticali di livello 4 e loro dendriti in topi neonati. Risultati ottenuti dall’applicazione del presente protocollo, che comprende due metodologie, sono riportati nella nostra recente pubblicazione5. In primo luogo, utilizziamo la Supernova vettore sistema5,6 per le etichette dei singoli neuroni nel cervello neonatale. Nel sistema Supernova, le proteine fluorescenti utilizzate per l’etichettatura di un neurone sono atterramento intercambiabili e con etichetta gene cellula-specifico e analisi di modifica/eliminazione diretta sono anche possibili. In secondo luogo, descriviamo una procedura chirurgica per la preparazione di finestra cranica in topi neonatali fragili. Insieme, queste metodologie consentono l’osservazione in vivo di singoli neuroni nel cervello neonatale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fasi critiche nel protocollo e risoluzione dei problemi:
La fase più critica del protocollo è la rimozione del cranio (passo 3.2 del protocollo). Al momento dell’inserimento, la lama di rasoio spesso aderisce al dura, provocando sanguinamenti dural e danni al cervello. Questo può essere evitato aggiungendo una goccia di tampone di corteccia sul cranio e rimuovendo il cranio nel buffer di corteccia.
Sanguinamento da dura e la pelle dopo preparazione cranica finestra …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano T. Sato, M. Kanbayashi e S. Kouyama per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da JSP KAKENHI Grant numeri JP15K14322 e JP16H06143, la Takeda Science Foundation, la Fondazione Memorial Uehara e il Collaborative Research Project di Niigata University Brain Research Institute 2017-2923 (H.M) e da KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 e JP15H04263 e Grant-in ricerca scientifica sulle aree dell’innovazione “Regolazione dinamica della funzione del cervello di Scrap & Build System” (JP16H06459) dal MEXT (T.I.).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Autores | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Autores | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
Referencias
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