Обнаружение и изоляция Apoptotic тел с высокой чистоты
Summary
Рабочий процесс с помощью потока цитометрии или дифференциального центрифугирования разрабатывается для выявления, количественной оценки и изолировать apoptotic тела от apoptotic образца к высокой чистоты.
Abstract
Apoptotic тела (ApoBDs), микровезикулы и exosomes являются ведущими членами семьи внеклеточного везикул, с ApoBDs, являясь одним из крупнейших типа. Было предложено, что ApoBDs могут помочь клеток разминирования, а также межклеточные связи через людьми биомолекул. Традиционные подходы, используемые для идентификации и изоляции ApoBDs часто ограничивается отсутствием точной количественной оценки и низкой образец чистоты. Здесь мы описываем рабочего процесса для подтверждения индукции апоптоза, проверить ApoBD формирования и изолировать ApoBDs высокой чистоты. Мы также наброски и сравнить активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS) и дифференциального центрифугирования основанные подходы к изоляции ApoBDs. Кроме того, чистоту изолированных ApoBDs будет подтверждено с помощью ранее установить потока на основе цитометрии окрашивание и аналитического метода. Взятые вместе, используя описанный подход, THP-1 Моноцит апоптоз и apoptotic клеток разборки был индуцированных и проверены, и ApoBD, созданный из моноцитов THP-1 были изолированы для чистоты 97-99%.
Introduction
Апоптоз, изученной форма запрограммированной смерти клетки, требуется для поддержания физиологического гомеостаза и удалить потенциально вредные клетки внутри человеческого тела1. После индукции апоптоза apoptotic клетки (ApoCells) можно пройти ряд морфологических изменений и разбирать в малых мембраны прыгните везикулы, называют ApoBDs. В целом этот процесс известен как apoptotic клеток разборки и можно разделить в 3 отдельных шагов, основанный на морфологию2,3. Шаг 1 (плазматической мембраны блеббинг) характеризуется образованием шар подобных структур на поверхности клеток, известный как шелесту4,5. Шаг 2 (apoptotic выступ формирования) включает в себя создание длительного мембраны выступы как apoptopodia, apoptopodia бисером и микротрубочек шипов6,7,8. И наконец шаг 3 (образование ApoBD) включает в себя фрагментация apoptotic выступов или ApoCells для создания ApoBDs6,9. Предыдущие результаты предложили роль ApoBDs в пособничестве apoptotic клеток распродажа и посреднической межклеточные связи. Например предлагается, что фрагментация ApoCell на ApoBDs может создавать небольшие «укус-определенные размер» которые могут быть легко удалены путем окружать фагоциты2,10,11. Кроме того ApoBDs может гавани серии биомолекул, такие как ДНК, РНК и белков, которые могут быть незаконно в окружающие клетки для облегчения ячеек связи12,,1314. Функционально расследовать эти процессы, жизненно важно, чтобы подтвердить три ключевые параметры, включая (i) проверки индукции апоптоза и формирования ApoBD, (ii) изоляции ApoBDs и (iii) подтверждения чистоты ApoBD.
Ранее ряд методов, включая проточной цитометрии и электронной микроскопии были использованы для изучения апоптоза и ApoBDs15,16,17,18. Однако ApoBD обнаружения и количественного определения зачастую трудно или упускается из виду. Например, наиболее широко используется поток на основе цитометрии апоптоз пробирного использует annexin V (A5, белок, который связывается externalized ‘ поесть-меня ‘ сигнала фосфатидилсерина (PtdSer)) и нуклеиновых кислот пятна пропидий йодидом (PI)19. Однако с помощью этой универсальной пятно комбинации, анализ предполагает, что есть только три типа клеток подмножеств (жизнеспособных клеток, ApoCells и отмершие клетки) в образце. Кроме того хотя рассматривается как «золотой стандарт» многими исследователями для apoptosis, assays проточной цитометрии и последующего анализа данных часто исключает ApoBDs через первоначальный стробирования шаг, выбрав FSC/SSCсредний высокий события. Таким образом мы недавно разработали пробирного цитометрии Роман потока, используя A5 и TO-PRO-3, другой нуклеиновых пятно, которое может быть выборочно take up каспазы-3/7-активированный Паннексины 1 (PANX1) каналы207,. Как 3-индуцированной PANX1 активацию caspase предшествует PtdSer воздействия на ранней стадии апоптоза, TO-PRO-3 дифференциально пятна apoptotic и отмершие клетки. Кроме того, этот подход в сочетании с нашими Роман стробирования стратегия включает в себя все полученные события при анализе данных и в результате, определены шесть клеток/частиц подмножеств, включая: (i) жизнеспособных клеток (FSC/SSCсредний/высокий, A5низкая , TO-PRO-3низкий), (ii) A5– ранней ApoCells (FSC/SSCсредней/высокой, A5низкий, TO-PRO-3промежуточных), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCсредний/высокий, A5Высокая , К-PRO-3промежуточных), (iv) отмершие клетки или позднего ApoCells (FSC/SSCсредней/высокой, A5высокий, TO-PRO-3высокий), (v) ApoBDs (FSC/SSCнизкий, A5промежуточных, TO-PRO-3низкая / промежуточные) и (vi) мусора (FSC/SSCнизкий, A5низкий, TO-PRO-3низкий)20. Наш подход подчеркивает важность анализа всех подмножеств клетки/частиц и, что более важно, разделение ApoBDs от клеток и мусора20. Таким образом этот подход демонстрирует эффективную технику для проверки индукции апоптоза и формирования ApoBD одновременно.
Традиционно ApoBDs были выделены через разнообразные подходы дифференциального центрифугирования, whereby ApoBDs может быть отделена от клетки или другие внеклеточного везикулы, основанный на плотность. Однако такие методы Центрифугирование часто ограничивается низкой ApoBD чистота, отсутствие количественной оценки шаг для подтверждения чистоты образца, и/или неспособность отделить ячейки конкретного типа ApoBDs17,21,22. Поэтому мы недавно разработали два подхода, основанного на СУИМ и новый дифференциального центрифугирования основанный подход, который может использоваться в сочетании с нашим ранее установленных потока цитометрии метод для проверки индукции апоптоза и образец чистоты23. ApoBD изоляции через наш подход, основанный на СУИМ может обогатить ApoBDs до 99% чистоты и может использоваться в сочетании с разнообразием антител определенного типа клеток изолировать ApoBDs от смешанных клеточных популяций, образцы тканей и жидкостями23. Кроме того, наш пересмотренный дифференциального центрифугирования подход демонстрирует эффективный метод для изоляции ApoBDs к > 90% чистоты23.
В этой статье мы подробно описать нашей экспериментальной процедуры для проверки индукции апоптоза и для выявления и количественной оценки ApoBD формирования. ApoBD изоляции процессов на основе СУИМ и методами дифференциального центрифугирования основе также разработана и сравнить. Репрезентативных данных показывают, что описывается методология обеспечивает эффективный инструмент передовые для будущих исследований ApoBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Начиная с его ранних описание в 1950-х поле apoptosis передовые заметно, став область выдающихся исследований. Несмотря на широкий интерес и активные усилия некоторые аспекты апоптоза, в частности формирования ApoBDs, не были хорошо изучены из-за отсутствия надлежащих методологий. Эти особеннос…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это работал было поддержано субсидии от национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (GNT1125033 и GNT1140187) и Австралийский исследовательский совет (DP170103790) I.K.H.P.
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
Referencias
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
- Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
- Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
- Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
- Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
- Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
- Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
- Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
- Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
- Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
- Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
- Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
- Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
- Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
- Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
- Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
