여기, 두 세포 외 기 격리 프로토콜, 한 원심 분리 및 밀도 그라데이션 원심 분리, extracellular 소포 murine bronchoalveolar 게 액체 샘플에서 분리 된 ultracentrifugation 설명 합니다. 두 방법으로 murine bronchoalveolar 게 액체에서 파생 된 세포 외 소포는 계량 하 고 특징.
Extracellular 소포 (EVs)는 많은 생물학 기능 생리 및 병리학 상태 동안 신호에 중요 한 역할을 하는 새로 발견된 된 subcellular 요소입니다. EVs의 각 기법에 기본 제한으로 인해이 분야에서 주요 도전 되 고 있습니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 방법으로 차동 ultracentrifugation 일반적으로 사용 되는 방식 이며, EV 격리에 대 한 표준 절차로 간주 됩니다. 그러나,이 절차 시간이, 노동 집약, 그리고 일반적으로 bronchoalveolar 게 액체 같은 작은 볼륨 샘플에 적합 하지 않을 수 있습니다 낮은 확장성에서 결과. 한 원심 분리 방법 간단 하 고 시간 및 노동 효율 아직 제공 높은 복구 수율 및 순도 설명 합니다. 우리는이 격리 방법 EV 격리, 작은 볼륨 생물학 견본을 위해 특히 적합 한 대체 접근 될 수 있는 제안 합니다.
Exosomes는 EVs, 50-200 nm 직경에서의 작은 하위 집합 그리고 신호 처리1,2,3,,45의 다양 한 배열을 통해 여러 생물 학적 기능을가지고. 그들은 주로 지질, 단백질 및 핵 산6,,78,9 등 화물 분자 세포 통신을 촉진 하 여 세포와 조직의 항상성 적용 . EV 연구에서 하나의 중요 한 단계는 격리 프로세스입니다. 차동 ultracentrifugation (UC), 또는 밀도 그라데이션 원심 (DGC) 없이 황금 표준 접근 방식으로 간주 됩니다 하지만이 방법은 비효율적 EV 복구 속도 낮은 확장성10 를 포함 하 여 주요 제한 사항 , 11 , 12, 그 큰 볼륨 샘플, 셀 문화 표면에 뜨는 또는 높은 exosome 생산 표본 등의 최고의 사용률을 제한합니다. 적용 또는 크로마토그래피, immunoaffinity 격리 구슬 또는 열 및 마이크로, 크기 배제 같은 다른 방법의 장단점은 잘 설명 하 고 현대 보충 절차 개발 되었습니다. 극복 하 고 각 접근11,12,13,,1415에 기술적 한계를 최소화 합니다. 다른 필터 단위에서 성공 막으로 한 원심 (UFC) UC 방법16,,1718에 비해 순도 제공 하는 대체 기법입니다 나타났습니다. 이 기술은 다른 절연 방법 중 하나로 간주 될 수 있습니다.
Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 들어 EVs를 다양 한 호흡기 조건19,20,,2122에서 다양 한 생물 학적 기능을가지고 있습니다. 공부 BALF 파생 EVs 임무 인 인간, 상계 절차로 제한 된 양의 게 유체 복구의 침입으로 인해 몇 가지 도전. 쥐 같은 작은 실험실 동물에 몇 밀리 리터 정상적인 폐 조건에서 복구할 수 있습니다, 그리고 염증 또는 거리 폐23에 덜도. 따라서, EV 격리에 대 한 충분 한 양의 BALF 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 차동 ultracentrifugation에 의해 수집 수 있습니다 실현. 그러나, 올바른 EV 인구 격리 EV 생물 학적 기능을 공부에 대 한 중요 한 요소 이다. 효율성과 효능 사이의 미묘한 균형 잘 설립 EV 격리 방법에 도전 하 고 있습니다.
현재이 연구는 100 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) nanomembrane 필터 단위를 활용 하 여 원심 외 접근 BALF 같은 작은 볼륨 생물 표본 적합은 보여 줍니다. 이 기술은 간단 하 고 효율적으로, 그리고 높은 순도 BALF 파생 EVs의 연구를 지 원하는 확장성을 제공 합니다.
지난 몇 년간, 과학자는 세포 항상성에서 EVs의 significances unraveled는. 더 중요 한 것은, EVs 역할 주요 많은 질병 과정에 그들의 생리 화물 분자1,21,22,,2627 를 통해 이웃과 먼 셀을 변조 하 여 , 28 , 29 , 30</s…
The authors have nothing to disclose.
작품은 NHLBI/NIH 교부 금 HL103868 (컴퓨터)에 및 HL137076 (시공)를, (PC)를 미국 심장 협회 선진적인 및 Samuel Oschin 포괄적인 암 연구소 (솟) 폐 암 연구 상 (컴퓨터)에 의해 지원 됩니다. 우리는 우리에 게 EV 나노 분석 추적에 대 한 Nanosight 기계를 제공 하는 삼목 시 나이 의료 센터에 Smidt 심장 연구소에 우리의 큰 감사를 표현 하 고 싶습니다.
Material | |||
Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
Angiocatheter 20G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
CD81 | |||
CD9 | |||
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
4x LDS | |||
10x Reducing agent (Bolt) | |||
10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | – | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | – | |
Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | – | To measure particle size distribution and particle concentration |
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | – | |
iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | – | |
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
FlowJo v. 10 | Analysis software |