JoVE Journal > Immunology and Infection
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Inmunología y contagio

ラベル無料三次元定量的な位相画像を用いたリンパ球サブタイプの同定と機械学習

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

定量位相イメージングと機械学習アルゴリズムを用いたリンパ球サブタイプの無料のラベル識別のためのプロトコルについて述べる。リンパ球の 3 D の屈折断層の測定は、細胞の種類を識別するための機械学習アルゴリズムで分析します個々 のセル、3 D の形態学的および生化学的情報を提示します。

Abstract

我々 はここで定量的な位相画像と機械学習を用いたリンパ球サブタイプの無料のラベル識別のためのプロトコルについて説明します。リンパ球サブタイプの同定診断と同様に、免疫学の研究や様々 な疾患の治療が重要です。現在、リンパ球の種類を分類するための標準的な方法は、抗原抗体反応による特定の膜タンパク質をラベルに依存します。ただし、これらの分類の技術は、細胞機能の変更の潜在的なリスクを運ぶ。ここで説明されているプロトコルは、3 D の定量位相イメージングと機械学習アルゴリズムを用いて本質的な光のコントラストを利用してこれらの課題を克服します。リンパ球の三次元屈折率 (RI) 断層の測定は、3 D 形態、個々 のセルの表現型についての定量的な情報を提供します。測定 3 D RI 断層から抽出された生物物理パラメーターは、単一細胞レベルでリンパ球型のラベル フリーの識別を有効にする機械学習アルゴリズムを用いた定量的に分析しています。B、T cd4 および cd8 陽性 T リンパ球の 3 D RI 断層を測定し、80% 以上で、細胞の種類を識別精度。このプロトコルではリンパ球の隔離、3 D 定量位相イメージング、およびリンパ球の種類を識別するための機械学習のための詳細な手順をについて説明します。

Introduction

B、レギュラトリー T 細胞 (cd 8 +) T、(cd 4 +) T ヘルパーを含む様々 なサブタイプに分けられるリンパ球細胞。各リンパ球型適応免疫システムに異なった役割を持ってください。たとえば、B リンパ球は T リンパ球特異抗原を検出、異常な細胞を排除して B リンパ球を調節するのに対し、抗体を生成します。リンパ球機能と規制は密によって制御され癌1、自己免疫疾患2、ウイルス感染症3を含む様々 な疾患に関連。したがって、リンパ球の種類の同定はこのような疾患、免疫療法の診療所での病態生理学的役割を理解することが重要です。

現在、リンパ球の種類を分類するための方法は、特定の表面膜蛋白質または表面マーカー4対象に抗原抗体反応に依存します。表面のマーカーをターゲットはリンパ球の種類を決定する正確かつ正確な方法です。ただし、高価な試薬および時間のかかる手順が必要です。さらに、それは膜蛋白質の構造の変更や細胞機能の変化のリスクを運ぶ。

これらの課題を克服するためには、ここで説明されているプロトコルは、3 D 定量位相イメージング (QPI) と機械学習5を使用してリンパ球タイプのラベル フリー識別を紹介します。このメソッドは、個々 のリンパ球のラベル無料 3 D 画像から抽出した形態学的情報に基づく単一細胞レベルでリンパ球型の分類できます。従来の蛍光顕微鏡技術とは異なり QPI は光のコントラスト6,7として屈折率 (RI) 分布 (生きている細胞や組織の本質的な光学特性) を利用しています。個々 のリンパ球の RI 断層は、リンパ球のサブタイプに固有表現型情報を表します。この場合は、全身の個々 のリンパ球の 3 D の RI 断層を利用する教師つき機械学習アルゴリズムが利用されました。

QPI のさまざまなテクニックを使用して、セルの 3 D RI 断層使用されている積極的に細胞病態学ラベル無料提供するため定量的イメージング機能8,9,10, 11,12,13。また、個々 のセルの 3 D RI 分布細胞形態学的、生化学的、および生体力学的情報を提供します。3 D の RI 断層は、以前血液14,15,16,17, 感染症18,19、の分野で利用されている20、免疫学21、細胞生物学22,23、炎症24、がん25, 神経科学26,27、発生生物学28, 毒物学29、および微生物学12,30,31,32。

3 D RI 断層は、細胞の形態学的および生化学的な詳細を提供する、リンパ球サブタイプの分類は単にイメージング 3 D RI 断層5で達成するために困難であります。体系的かつ定量的細胞型分類のため測定された 3 D RI 断層を悪用、機械学習アルゴリズムを利用しました。最近では、いくつかの作品報告されているどの定量細胞の画像を分析した様々 な機械学習アルゴリズム33、微生物34、35細菌属の分類の検出など,36, 炭疽菌胞子37, 迅速かつ無料のラベル検出は、精子細胞38の解析、マクロファージ活性化41の癌細胞39,40, の分析と検出を自動化しました。

このプロトコルは、3 D QPI と機械学習を用いた個々 の細胞レベルでのリンパ球型の無料のラベル識別を実行する詳細な手順を提供します。これが含まれます: 1) リンパ球分離マウス血、2) リンパ球が 3 D の RI 断層から流れ cytometry、3) 3 D QPI 4) 定量的特徴抽出による並べ替えおよび 5) リンパ球の種類を識別するための学習から。

Protocol

動物介護施設使用 (KA2010 21, KA2014-01 と KA2015-03) 委員会の KAIST の承認の下で動物の世話と実験手順を行った。承認されたガイドラインに基づき本研究のすべての実験を行った。 1 マウスの血液からリンパ球の隔離 C57bl/6 j マウスに CO2吸入による安楽死は一度マウスの心臓に 26 G 針を挿入し、血液の 0.3 mL を収集します。直接リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1 mL で?…

Representative Results

図1は、プロトコル全体のプロセスの概略を示しています。ここに示す手順を使用して、我々 は B を分離した (n = 149)、cd 4 + T (n = 95)、および cd 8 + の T (n = 112) リンパ球。照明の様々 な角度での位相および振幅情報を取得するには、(-60 ° ~ 60 °) からの照明の角度を変更することによって各リンパ球の複数の 2 D ホログラムを測定しました。通?…

Discussion

3 D 定量位相イメージングと機械学習を利用したリンパ球の種類の無料のラベル識別を可能にするプロトコルを提案します。このプロトコルの重要なステップは、定量的な位相画像と機能の選択です。最適なホログラフィック画像上記のように細胞の密度を制御する必要があります。細胞の機械的安定性も浮動または振動の細胞挙動は照明角度変更時にホログラム測定を妨げるので正確な 3次?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、KAIST bk 21 + プログラム、Tomocube、株式会社と、国立研究財団 (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396) によって支えられました。Y. ジョーは、KAIST 大統領交わりからアサン財団生物医学科学奨学金サポートを認めています。

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
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Referencias

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Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
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