剛体の埋め込み固定し、ステンド グラス、全体、マイクロ コンピューター断層撮影によってセクション-無料の 3 D の組織学のためのミリ波スケール標本

本稿では、マイクロ CT イメージング用 (0.5 から 2.5 mm 径) 標本固定と染色ミリ スケールの剛体の固定化のための詳しいプロトコルを提案します。解像度と速度に関してマイクロ CT 技術の急速な進歩を考えると、再イメージング機能を持つ恒久的なサンプル保存の方法は、非常に望ましいです。伝統的に、超薄切片を切り、試料へのダメージを最小限に抑えるために構造サポートを提供するために、密な埋め込み樹脂が電子顕微鏡でに使用されます。本手法は適応非破壊イメージング中に剛体の固定化のための使用です。余分な樹脂の存在から画像アーチファクトを最小限にするには、x 線透明ポリイミド チューブ サンプルの周りの樹脂量を制限して、エッジのないラウンドのサンプルを作成するの使用を実施いたします。

埋め込みの手順の最適な結果のいくつかの重要なステップとサンプル プロシージャ全体で整合性に注意慎重に実行に依存しています。確かに、供試体の損傷は、イメージングの実行の成功に関係なく危険にさらされた最終的なイメージになります。痛みの反応の減少に貢献する低温未固定組織が高温でより急速に低下するので、我々 は中古冷蔵試薬を使用します。大規模な標本は、肝、膵、腸などの内臓は完全に固定して試料の内部に定着剤のエントリを許可するようにカットする必要があります。固定されていない組織は、悪化し、生物学的構造を破壊する構造の健全性を失います。もう一つの重要なステップは、その自然な配置で供試体を維持することです。したがって、プロシージャと固定の間に特に重要なは全体を用いて平底の容器の使用を主張します。固定ポリプロピレン チューブまたは V 字の底を持っている通常の円錐管避けなければならない原因を曲げないように、細長いサンプル標本の自然な形態を歪められて。さらに、樹脂の使用を最小限に抑えるため古河ポリイミド チューブの内径は試料の幅よりわずかに大きいだけ。供試体の曲げでも、損傷試料管に入ってきた。また、管に有害な四肢を避けるために自然な前方方法で供試体を転送することをお勧めします。適切な脱水は、別の重要なステップです。ゆっくりより樹脂混和性であるエタノールと水を交換するエタノール濃度の増加の小さな単位で行われます。エタノール濃度の大きな増加は組織収縮に関連付けられ、江藤潜伏移行をより緩やかにするための追加の単位によって改善することができます。最後に、いずれかがある場合、試料または空気のポケットの動きを最小限に抑えるサンプル時は配置された水平樹脂重合 (第 4 日終了)。空気のポケットまたは標本の横にあるシール エッジ回折、画像品質を下げることに関連付けられている x 線イメージングと光のアーティファクトが発生します。

プロトコル、その他の埋め込み樹脂および金属に可能な修正に関して汚れそれぞれ LR ホワイト アクリル、PTA、代わりに使用することができます。Embed812、電子顕微鏡でよく使用されるエポキシ樹脂は高粘度、転送が難しく、試験片の歪みが生じる、アクリルまたはリコールのメタクリル樹脂よりも高いバック グラウンドに関連付けられています。JB4 プラス、グリコール メタクリル酸 EMbed812 よりも粘性が低くより低い背景には、空気のポケットのランダムな形成は試料近傍よく表示されます。前述のように、空気のポケットは画像品質が低下して、貴重なサンプルのため特に問題となります。それは最終的なイメージで貧しいコントラストをもたらす PTA 染色と干渉する Technovit 7100、メタクリル酸グリコール別、注目に値するです。比較的、LR ホワイト アクリルは水のような粘度、低バック グラウンド、PTA 染色と干渉しません。私たちの手で LR ホワイト サンプル損傷や気泡のない埋め込みの成功率は 95% 以上です。これらの理由から、我々 は組織のマイクロ CT の埋め込み樹脂として使用を提唱します。汚れに関して様々 な金属の結果ヨウ素、四酸化オスミウムなど汚れとマイクロ CT イメージングで PTA に比べて、他の場所で説明した^15,16,17をされており、この範囲外は原稿。

サンプル サイズは、私たちの現在のプロトコルの主要な制限です。チューブに試料を転送するための吸引を用いて、供試体を見る能力オリエンテーションと確かにチューブであることを確保するため非常に重要です。結果として、クマムシなどサンプルのサブミリ (すなわち。、水クマ) 顕微鏡可視化することが要求されるので、埋め込むことは非常に困難です。吸引を適用すると、顕微鏡標本は焦点面から簡単に失われ、彼らはチューブの添付の終わりまであまり渡されるかどうかを決定するが難しく、再発見するに困難になります。マウス胚、(3-10 mm) などの大きなサンプル (図 4) プロトコルを埋め込むにわずかな変更で埋め込むことができます。特に、ポリイミド チューブは、1/3 埋め込む前に重合した液体の樹脂に満ちていた。固定と染色のサンプルは、事前重合樹脂の上に置かれました。チューブが完全に非重合樹脂を充填、2 番目の重合後に。

プロトコルを埋め込む、性は多様です。堅く固定化全体の動物や組織標本などの理由で望ましい: (1) 生成や準備が難しいサンプルの長期的なリポジトリの作成(2) データの再取得(3) シリアル複数の画像形式を使用してイメージングを有効にします。校正および技術開発のため (4) 基準。サンプルの埋め込み手順と準備は損傷に対して弾力性のある固体樹脂を包んだ、したがって簡単に保存できますおそらく無期限に。長期保管は稀または苦心して生成された標本フェノーム プロジェクトに関連付けられているなどの場合に特に便利です。さらに、デジタル データが失われた場合に、データは元のサンプルから生成できます。可能性のある長い期間にわたって再イメージングの能力は同じサンプルで尋問を画像診断、将来的に高度なことができます。サンプルがイメージング インスタンス間物理的に安定しているので、画像は以前とそれ以降のデータ セット間の登録を促進する、同じ方向に同じ標本から取得されます。たとえば、低解像度の画像がゼブラフィッシュ幼虫組織の分割に限定します。同じ幼虫は、携帯電話の解像度で計算解析の詳細に高い解像度で再イメージング後することができます。登録スキャン間の直接比較のためこの機能は、潜在的なマイクロ ct 技術開発のための標準として樹脂包埋試料を示唆しています。サンプルの準備のステップですべての変数を制御して、同一試料のイメージングによるイメージング法に変更の影響を評価できます。最後に、測定器の校正の場合、イメージングの一貫性をテストする樹脂に埋め込まれた標準的なサンプルを使用できます。

筆者らは突然変異と病気の魚組織を調べることを示した携帯電話の解像度が、解剖顕微鏡³⁶、または低消費電力を使用して総検査で見落とされる組織構造の微妙な異常の検出を可能ステレオの顕微鏡。人間のサンプルを当社の高分解能解析を展開したいです。開発事業の主な対象を構成する、ゼブラフィッシュの幼虫は、脆弱性、細胞、細胞間の組織の不均一性、サイズ (直径 1-3 mm)、細長い形状でひと針生検に似ています。ゼブラフィッシュ、低い解像度³⁷でとはいえそのマイクロ CT が正常に染色し、ヒト組織をスキャンを示す他の仕事と当社の豊富な経験に基づき、イメージングや針生検の解析に付加価値をもたらすための私たちのアプローチを見込んでいます。我々 と推定している 30 ドルよりも少ない可能性があります同じ条件の最大 20 のサンプルの 1 つの準備のため十分なキットのアセンブリ。物理的な損傷に耐性のため運搬しやすい埋め込み手法により作製したサンプル。低コストと輸送の容易さは特にエリア細胞分解能マイクロ CT 観察が容易にアクセス可能ではないの世界中からサンプルのコレクションの可能性を示唆します。私たちのビジョンは、針生検 (0.1 から数テラバイトまで) の高解像度デジタル ・ ファイル ヒト組織のデジタル地図の作成を有効にすると同時に改良、現在解析パイプラインを強化して研究者を許可します。ローカリゼーションとフル 3 D スキャン組織のコンテキスト内での細胞およびティッシュのアーキテクチャの定量的な特徴づけ。