JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

Published: September 01, 2018
doi:
10.3791/58267
, ,
1Evolution and Genetics, Department of Biosciences,University of Oslo

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור השימוש קיימות מגירות עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה בונה כבסיס ליצירת מוטציות מחיקה זנים אחרים e. coli . מוטציות מחיקה כאלה יכולים להיות גייסה ונוסף מיקומה המקביל של זן נמען באמצעות התמרה חושית bacteriophage P1.

Abstract

בגישה הראשונה ללמוד את תפקוד ג’ין לא ידוע של חיידקים היא ליצור את מדהימה של הגן הזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול חזקה ומהירה להעברת מחיקה מוטציות מהמאמץ Escherichia coli אחד למשנהו באמצעות bacteriophage P1 שימוש התמרה חושית מוכללת. שיטה זו דורשת כי המוטציה להיות ניתן לבחירה (למשל, בהתבסס על הפרעות גנטי באמצעות קלטת לאנטיביוטיקה הוספות). קלטות לאנטיביוטיקה כזה יכול להיות גייסה מכל זן התורם מוחדרים זן הנמען עניין במהירות, בקלות ליצור מוטציה מחיקה ג’ין. ניתן לעצב בקלטת לאנטיביוטיקה כדי לכלול flippase זיהוי אתרים המאפשרים הכריתה של הקלטת על ידי recombinase בייעודי לאתר כדי לייצר את מדהימה נקי עם רק צלקת ~ 100-בסיס-זוג-ארוך רצף הגנום. אנו מדגימים את הפרוטוקול על ידי לדפוק את הגן של טאמה קידוד גורם הרכבה מעורב autotransporter להן, לבחון את השפעת הזה מעלף על להן והתפקוד של שני trimeric autotransporter adhesins. למרות המחיקה הגן על ידי התמרה חושית P1 יש מגבלות משלו, קלות ומהירות של יישומה להגיע חלופה אטרקטיבית בשיטות אחרות של ג’ין מחיקה

Introduction

גישה ראשונה משותפת ללמוד את הפונקציה של הגן הוא ביצוע מעלף מוטגנזה מכוונת ולבחון את פנוטיפ וכתוצאה מכך. זה נקרא גם גנטיקה הפוכה. חיידק e. coli כבר סוס עבודה של ביולוגיה מולקולרית במשך 70 השנים האחרונות, או אז, בגלל הקלות של culturing שלה, שלה amenability מניפולציה גנטית1. פותחו מספר שיטות כדי לייצר ג’ין מחיקות ב e. coli, כולל סמן exchange מוטגנזה מכוונת2,3 , לאחרונה, recombineering באמצעות λ אדום או Rac ET מערכות4,5 , 6.

במערכת בשימוש נרחב, קידוד רצף של גנים יחידניים מוחלפים קלטת עמידות לאנטיביוטיקה זה אפשר להוציא אחר כך5,של כרומוזום7. רצפי קידוד מוחלפים, למשל קלטת ההתנגדות kanamycin (קאן), אשר מוקף flippase (FLP) זיהוי אתרי היעד (והשפלתם) משני הצדדים. האתרים והשפלתם מזוהים על-ידי recombinase FLP, אשר שמתווכת בייעודי לאתר רקומבינציה בין האתרים והשפלתם שמוביל המחיקה של קלטת קאן. בדרך זו, פעולת מחיקה מלאה של רצף קידוד של גן מסוים יכולה להיות מושגת, משאיר מאחור רק צלקת מינימלית רצף של בסיסי כ-100 זוגות (bp) (איור 1).

רק לפני כעשור, פותחה האוסף קאיו כביכול. זוהי ספרייה חיידקי בהתבסס על מעבדה סטנדרטיים זן K12 e. coli , שבו כמעט כל הגנים שאינם חיוניים נמחקו בנפרד על ידי λ רקומבינציה אדום7,8. בתוך אוסף זה כל שלשיבוטים רצף קידוד אחד הוחלפו קלטת התנגדות ניתן לניתוח קאן. האוסף קאיו הוכיחה להיות כלי שימושי עבור יישומים רבים9. יישום אחד כזה הוא הייצור של מחיקה מוטציות בזנים אחרים e. coli . יכול להיות גייסה בקלטת קאן שיבוט נתון מחיקה מאת בדרך כלל transducing bacteriophages, כגון P110,11,12,13,14. מניה phage שהוכנו בכזה מתח יכול לשמש לאחר מכן להדביק את הנמען e. coli זן של עניין, איפה בתדר נמוך אבל אמין קן אזור המכילים קלטת ניתן לשלב לתוך הגנום הנמען מאת רקומבינציה הומולוגית (איור 2). Transductants ניתן לבחור את הצמיחה על המדיום המכיל קאן. בעקבות זאת, אם הסרת הקלטת עמידות לאנטיביוטיקה היא הרצויה, recombinase FLP יכולות להיות מסופקות המתח transductant טרנס. לאחר ריפוי של פלסמיד המכיל FLP, אשר נושאת סמן ההתנגדות אמפיצילין (אמפר), שיבוטים קאן לבין מגבר רגיש מוקרנים במשך ולאחר הכריתה הנכון של הרצף פראי-סוג קידוד ובקלטת קאן אומתו המושבה PCR.

. הנה, פרוטוקול מפורט מוצג, המתארת את כל השלבים בהפקת זן e. coli בהתבסס על האסטרטגיה שפורטו לעיל את מדהימה. כדוגמה, הוא הפגין מחיקה של הגן בתמ א . תמ א מקודד חלבון β-חבית של הממברנה החיצונית היא חלק של הובלה, הרכבה מודול (TAM), אשר עוסקת להן autotransporter חלבונים מסוימים, pili15,16,17. זן זה מעלף שימש אז כדי לבחון את ההשפעה של המחיקה תמ א על להן של trimeric autotransporter שתי adhesins (תעש), adhesin Yersinia את ידה של אימונוגלובולין e. coli (Ig)-מחייב TAA EibD 18,19.

Protocol

1. זנים, פלסמידים זני חיידקים השתמש e. coli זנים BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20, BL21ΔABCF21. ראה טבלה של חומרים למידע נוסף. Bacteriophages להשתמש את phage P1vir התמרה חושית כללי. לאחסן את pha…

Representative Results

מהדור תמ א הנוק-אאוט של BL21ΔABCF: האסטרטגיה שפורטו לעיל בעבר שימש כדי לייצר זן נגזרות של BL21(DE3), זן מעבדה סטנדרטי המשמש לייצור חלבון, אשר אופטימיזציה עבור ייצור החלבון הממברנה החיצונית, שנקרא BL21ΔABCF21. זן זה חסר ארבעה גנים קידוד ?…

Discussion

התמרה חושית P1 הוא שיטה מהירה, חזקה ואמינה ליצירת ג’ין מחיקות ב e. coli. זה מומחש פה transducing מוטציה מחיקה תמ א של זן התורם קאיו לנמען נגזר BL21. השלבים העיקריים בתהליך התמרה חושית הן את הייצור של transducing lysate, את התמרה חושית עצמה, הכריתה של קלטת ההתנגדות קאן, ואימות של עקום החוצה על ידי ה-PCR. בסך…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

קאיו אוסף זנים התקבלו מפרוייקט BioResource הלאומית (כוש, יפן): e. coli. אנו מודים החיבור דירק (המחלקה של החיים, אוניברסיטת אוסלו) על תמיכתו המתמשכת. עבודה זו מומן על ידי המועצה למחקר של חוקר צעיר נורבגיה גרנט 249793 (כדי ג’ק ג לאו).

Materials

Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
  3. Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
  4. Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
  5. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  6. Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering–new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
  7. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  8. Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
  9. Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).
  10. Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
  11. Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
  12. Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
  13. Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
  14. Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
  15. Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
  16. Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
  17. Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
  18. Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
  19. Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) – Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
  20. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  21. Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
  22. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
  23. Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
  24. Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).
  25. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
  26. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  27. Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).
  28. Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
  29. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).
  30. Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
  31. Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
  32. Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
  33. Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
  34. Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
  35. Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
  36. Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
  37. Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
  38. O’Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).

Tags

P1 TransductionGene DeletionEscherichia ColiAntibiotic Resistance CassetteKnockout MutantPhageBacterial CultureLysogeny BrothCentrifugationChloroformSodium Citrate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image