Générant des Homo - et xénogreffe entre la pastèque et la gourde pour l’étude des microARN froid-sensible
Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé pour faire efficacement des homo – et xénogreffe entre pastèque et gourde, en plus des méthodes de prélèvement d’échantillons de tissus, la génération de données et l’analyse des données, pour l’étude des microARN froid-sensible.
Abstract
MicroARN (miARN) est endogènes petit non-codantes ARN d’environ 20-24 nt, connus pour jouer un rôle important dans le développement de la plante et l’adaptation. Il y a une accumulation preuve montrant que les expressions de certains miARN sont modifiées lorsque la greffe, une pratique agricole couramment utilisée par les agriculteurs pour améliorer la tolérance des cultures aux stress biotiques et abiotiques. La gourde est une culture intrinsèquement résilience climatique par rapport aux nombreux autres cucurbitacées majeures, y compris le melon d’eau, rendant l’un des porte-greffes plus largement utilisés pour le second. La promotion récente de technologies de séquençage haut-débit a fourni de grandes possibilités d’enquêter sur les miARN froid-sensible et leurs contributions aux avantages hétérogreffe ; Pourtant, les procédures expérimentales adéquates sont une condition préalable à cet effet. Nous présentons ici un protocole détaillé pour générer efficacement des homo – et xénogreffe entre le melon d’eau froide-sensibles et la gourde résistant au froid, en plus des méthodes de prélèvement d’échantillons de tissus, la génération de données et l’analyse des données. Les méthodes présentées sont également utiles pour d’autres systèmes de plantes-greffe, d’interroger miRNA règlements sous différentes contraintes environnementales, comme la chaleur, la sécheresse et la salinité.
Introduction
Greffage a longtemps été employé comme une technique agricole pour améliorer la production agricole et la tolérance aux stress biotiques et abiotiques1,2,3. Dans les systèmes heterografting, porte-greffes élites peuvent améliorer l’absorption de l’eau et les nutriments des plantes, renforcer la résistance aux agents pathogènes du sol et limiter les effets négatifs de la toxicité des métaux4,5, qui peuvent conférer les greffons un patrimoine vigueur de la croissance et une tolérance accrue aux stress environnementaux. Dans de nombreux cas, heterografting peut également avoir des répercussions qualités de fruits chez les plantes horticoles, menant à saveur de fruits améliorés et accroissement du contenu liés à la santé des composés6,7. Il a été constaté que le transfert longue distance de phytohormones, ARN, peptides et protéines entre le porte-greffe et le greffon est un mécanisme fondamental modulation de la croissance et le développement de reprogrammation de scion plantes8,9 ,,10. La greffe a été largement utilisée dans les études de signalisation sur de longues distances et le transport en ce qui concerne l’adaptation environnementale11. Expériences de greffes sont particulièrement puissants pour la détection sans ambiguïté des molécules transmises en récepteurs tissulaires ou vasculaire sap et activation ou suppression des cibles moléculaires en raison de la transmission de signal12.
ARN non codant, une grande classe d’ARN qui exercent des fonctions de régulation importantes dans les cellules, ont été signalés à jouer un rôle en facilitant l’adaptation des plantes au stress abiotique13. miARN est endogènes petit non-codantes ARN d’environ 20-24 nt. des études ont révélé le rôle régulateur des miARN dans divers aspects des activités de l’usine, tels que tire la croissance, des latéraux racine formation14,15,16, absorption des éléments nutritifs, le métabolisme de sulfate et homéostasie17et réponses aux stress biotiques et abiotiques insistent sur18. Récemment, l’expression des miARN et leurs gènes cibles étaient liés à la tolérance au stress dans les plants de concombre heterografted19de sel. Dans les greffons intervariety du raisin, les réponses de miRNA expression de contrainte de la sécheresse ont été trouvés à être dépendante de génotype20.
Le développement rapide et diminuant les coûts de la technologie de séquençage haut-débit ont fourni une excellente occasion pour l’étude des règlements de miRNA chez les plantes agronomiques. Pastèque (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), une récolte importante cucurbitacées cultivées dans le monde entier, est sensible aux basses températures. Calebasse (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) est une climat plus élastique cucurbitacées couramment utilisées par les agriculteurs à la greffe avec la pastèque. L’objectif principal de cette étude est d’établir une norme, efficace et la méthode pratique pour la fabrication de xénogreffe entre la pastèque (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) et la calebasse (Lagenaria siceraria [Molina] lettre standard). Ce protocole fournit également un schéma expérimental détaillé et méthodes analytiques pour l’étude de la régulation des expressions de miRNA après greffage, qui est utile pour révéler les mécanismes sous-jacents des avantages heterografting.
Le matériel végétal utilisé dans cette étude inclure le cultivar de la pastèque et le landrace gourde. Cultivar de la pastèque est un cultivar commercial à haut rendement mais sensibles aux basses températures. La gourde landrace est un porte-greffe populaire pour greffage avec pastèque, concombre et gourde, en raison de son excellente tolérance des basses températures21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrit en détail une méthode très efficace et reproductible pour faire homo – et xénogreffe entre la pastèque et la gourde. Cette méthode, ne nécessitant aucun équipement spécifique, est très facile à utiliser et a généralement un taux de survie très élevé de greffage. La méthode peut également être utilisée pour faire des greffes d’autres cucurbitacées, comme entre pastèque, concombre et citrouille.
Il est à noter que la taille relative (âge)…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31772191), le projet de recherche d’intérêt Public dans la Province du Zhejiang (2017C 32027), la clé Science projet de sélection végétale dans le Zhejiang (2016C 02051) et le Programme National pour le Support de Top-Notch jeunes professionnels (à P.X.).
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
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